CRISPR) minangka teknik panyuntingan genom generasi katelu: CRISPR ngrevolusi jagad

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) minangka teknik panyuntingan genom generasi katelu sing wis ngrevolusi jagad kanthi asil throughput sing dhuwur. Teknik iki wis digunakake kanggo nambani macem-macem penyakit lan infeksi biologis. Macem-macem bakteri lan prokariota liyane (kayata archaea) uga duwe sistem CRISPR/Cas9 kanggo mbela awake saka fag. Wis dilapurake yen strategi adhedhasar CRISPR/Cas9 bisa nyegah pertumbuhan lan perkembangan kanker payudara triple negative (TNBC) kanthi nargetake gen resistensi sing bisa diganti, transkripsi, lan regulasi epigenetik. Intervensi terapeutik iki bisa mbantu ngatasi masalah sing tantangan kayata resistensi obat sing diamati sanajan ing TNBC. Saiki, macem-macem cara digunakake kanggo ngirim CRISPR/Cas9 menyang sel target, kayata fisik (mode mikroinjeksi, elektroporasi lan hidrodinamik), virus (virus sing ana gandhengane karo adeno lan lentivirus) lan non-virus (liposom lan nanopartikel lipid). )-partikel). Senajan maneka warna model wis dikembangake kanggo nyinaoni panyebab molekuler TNBC, kekurangan metode sing sensitif lan tertarget kanggo ngirim alat panyuntingan genom in vivo mbatesi aplikasi klinis. Ringkesane, review iki kanthi komprehensif nliti kemajuan, tantangan, watesan, lan prospek perawatan CRISPR/Cas9 kanggo TNBC adhedhasar bukti sing ana. Kita uga nyoroti kepiye kombinasi kecerdasan buatan lan pembelajaran mesin bisa ningkatake strategi CRISPR/Cas9 ing perawatan TNBC.
Kanker ditondoi dening pembelahan sel sing ora bisa dikendhaleni, gangguan titik pemeriksaan siklus sel, lan mutasi ing gen penekan tumor (TSG) (Matthews et al., 2022). Saka macem-macem jinis kanker, kanker payudara minangka jinis kanker sing paling umum ing wanita lan nduweni tingkat kematian sing dhuwur ing saindenging jagad (Waks lan Winer, 2019). Kanker payudara minangka penyakit heterogen kanthi macem-macem ciri, kayata fitur histologis lan biologis, presentasi klinis lan prilaku, lan respon marang perawatan (Weigelt et al., 2010). Klasifikasi kanker payudara menehi wawasan sing tepat kanggo diagnosis kanker payudara lan prognosis tumor. Panggunaan biomarker umum lan fitur klinikopatologis wis dadi kriteria utama kanggo klasifikasi kanker payudara (Tsang lan Tse, 2019). Prognosis lan respon marang perawatan kanker payudara dipengaruhi dening akeh faktor, kalebu anané reseptor estrogen (ER), reseptor progesteron (PR), reseptor faktor pertumbuhan epidermal manungsa 2 (HER2/neu), lan tingkat histologis, jinis tumor, lan tingkat. ukuran lan metastasis kelenjar getah bening (Al-Tubaiti, 2020). Lima subtipe molekuler intrinsik kanker payudara wis diidentifikasi, kalebu luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, lan claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC minangka subtipe molekuler kanker sing ora ngekspresikake kabeh ER, PR, lan HER2 (Yin et al., 2020). Fitur patologis iki ana gandhengane karo TNBC, sing ngonfirmasi perkembangan sing cepet lan sifat sing luwih agresif tinimbang jinis kanker payudara liyane (Feng et al., 2018). Kajaba iku, Peru et al (2000) nggunakake teknologi microarray kanggo nglasifikasi ulang kanker payudara lan ngenali limang subtipe intrinsik kanker payudara (Cadenas, 2012). Kanker payudara basal-like minangka subtipe kanker payudara sing duwe fenotipe triple-negatif lan ana gandhengane karo perkembangan sing cepet. Perlu dicathet yen kabeh kanker payudara basal-like umume salah didiagnosis minangka TNBC, nanging mung 77% sing TNBC; Kosok baline, 71-91% TNBC iku kaya basal, nuduhake yen rong jinis kanker payudara iki tumpang tindih lan makili klasifikasi sing beda (Wang D.-Y. et al., 2019). Iki nggawe kabutuhan kanggo menehi ciri heterogenitas TNBC kanggo njlentrehake prognosis lan ngenali respon potensial kanggo perawatan saiki lan mbesuk. Kajaba iku, TNBC nyumbang 15-20% saka kabeh kasus kanker payudara lan luwih umum ing wanita ing umur 50 taun. Mutasi BRCA1 utawa BRCA2 wis dilapurake ing kira-kira 20% kasus TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Panliten uga nuduhake yen TNBC duwe lingkungan mikro kekebalan sing beda sing kalebu tingkat faktor pertumbuhan endotel vaskular sing dhuwur, makrofag sing ana gandhengane karo tumor (TAM), limfosit sing nyusup tumor (TIL), lan molekul liyane sing melu pertumbuhan lan migrasi tumor. Mulane, mangerteni lingkungan mikro TNBC iku penting banget kanggo prognosis lan perawatan (Fan lan He, 2022).
Kanggo netepake prognosis TNBC lan njamin perawatan sing efektif, diagnosis sing akurat, utamane adhedhasar imunohistokimia (IHC) kanggo ndeteksi ER, PR lan HER2, lan mamografi kanggo ndeteksi neoplasma payudara, iku penting. Nanging, mamografi ora bisa nggambarake fitur intratumoral kanthi cukup kayata nekrosis lan fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Amarga prognosis lan diagnosis sing ala nyegah dokter menehi resep obat sing tepat (Chaudhary, 2020), macem-macem strategi digunakake kanggo ningkatake perawatan kanggo pasien TNBC. Saiki, ana rong obat, doxorubicin lan cyclophosphamide, sing digunakake ing pasien TNBC lan wis nuduhake asil sing apik. Kajaba iku, obat platinum liyane digunakake, kayata carboplatin lan cisplatin (Sikov et al., 2015). Kajaba iku, inhibitor PARP kayata Olaparib, Velaparib, lan PF-01367338 wis digunakake minangka obat kemoterapi potensial kanggo perawatan TNBC (Ishino et al., 2018). Wiwit jalur sinyal Wnt/b-Catenin, NOTCH, lan Hedgehog wis dilapurake melu kedadeyan lan perkembangan TNBC, ngarahake obat menyang jalur kasebut bisa uga dadi strategi penting (Aysola et al., 2013). Sanajan operasi, terapi radiasi, lan kemoterapi tetep dadi andalan perawatan kanggo TNBC saiki, kemajuan sing signifikan wis digawe ing pangembangan perawatan anyar kalebu terapi sing ditargetake, imunoterapi, macem-macem alat panyuntingan gen sing ana gandhengane karo CRISPR kayata Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, prime editing, lan terapi gen sing ditargetake CRISPR/Cas9. Ing kene kita bakal fokus ing macem-macem alat panyuntingan gen sing ana gandhengane karo CRISPR sing digunakake ing perawatan TNBC. Antarane, CRISPR/Cas9 wis entuk perhatian sing akeh.
Cas9n, uga dikenal minangka Cas9 nickase, minangka varian rekayasa genetik saka protein Cas9 sing asale saka sistem panyuntingan genom CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Ing wujud asline, protein Cas9 ngandhut rong domain nuclease: RuvC lan HNH, fungsi utama yaiku pamisahan loro untaian DNA. Nanging, ing Cas9n, salah sawijining domain nuclease, HNH, dimutasi sacara genetik lan dadi ora aktif. Mulane, domain HNH saka Cas9n tetep ora berfungsi. Mung domain RuvC sing tetep aktif, sing ngidini Cas9n ngethok utawa nggawe istirahat ing untaian DNA tunggal (Trevino lan Zhang, 2014). Dibandhingake karo Cas9, Cas9n bisa kanthi efektif nyuda efek sing ora cocog karo target lan kanthi akurat ningkatake mekanisme ndandani sel. Cas9n bisa digunakake kanggo ngatasi macem-macem masalah, kayata nggawe istirahat ing lokasi tartamtu ing DNA untaian ganda. Kanggo tujuan iki, rong molekul Cas9n digabungake lan digunakake bebarengan (Yee, 2016). Kinase garis keturunan campuran 3 (MLK3) minangka protein kinase sing diaktifake mitogen sing dadi regulator utama sajrone metastasis TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 bisa ngaktifake pirang-pirang jalur sinyal sing nyebabake metastasis TNBC. Contone, jalur c-Jun N-terminal kinase (JNK) ngatur motilitas sel lan degradasi matriks ekstraseluler, lan MLK3 ngaktifake jalur JNK, saengga nambah motilitas sel lan menehi sifat invasif (Rattanasinchai lan Gallo, 2016). MLK3 uga ngatur EMT. Kanggo nindakake iki, ngaktifake faktor transkripsi hilir kayata Snail, Slug lan Twist. Faktor-faktor kasebut nyegah ekspresi penanda epitel lan ningkatake ekspresi penanda mesenchymal, sing nyebabake akuisisi fenotipe metastatik (Casalino et al., 2023). MLK3 wis diamati nduweni peran ing remodeling ECM lan aktivasi protease kayata matriks metalloproteinase (MMP) sing ngrusak ECM. Iki nggampangake invasi sel tumor lan nyebar menyang situs sing adoh (Katari et al., 2019). Dadi, panliten sadurunge nuduhake yen MLK3 nduweni peran penting ing TNBC. Rattanasinchai lan Gallo nggunakake model TNBC kanggo nyinaoni peran MLK3 lan nemokake manawa model kasebut ningkatake perkembangan kanker liwat jalur sinyal tartamtu. Dheweke nggunakake CRISPR/Cas9n kanggo nyunting MLK3 lan mirsani pangurangan metastasis TNBC sing signifikan (Rattanasinchai lan Gallo, 2016).
dCas9, sing asring diarani Cas9 sing ora aktif, minangka wujud turunan sing dimodifikasi saka protein Cas9. Ora kaya Cas9 aktif, dCas9 ora duwe aktivitas endonuklease, saengga ora bisa ngindhuksi pemecahan untaian ganda DNA. Mulane, dCas9 bisa digunakake kanggo nargetake wilayah tartamtu saka genom kanthi tepat tanpa owah-owahan utawa modifikasi urutan DNA (Wang et al., 2016). Ing dCas9, rong protein endonuklease, RuvC lan HNH, diinaktivasi kanthi nyuda residu asam amino sing penting. (Richter et al., 2016). Sanajan ora duwe aktivitas pembelahan DNA, dCas9 nduweni sawetara peran penting ing riset genetik lan bioteknologi. Contone, ngidini visualisasi wilayah tartamtu saka genom, nggampangake regulasi transkripsi, lan ningkatake modifikasi epigenetik (Brocken et al., 2018).
Faktor transkripsi ZEB1 (homeobox 1 pengikatan E-box driji seng) nduweni peran spesifik lan kritis kanggo ngatur transisi epitel-mesenkim (EMT), proses seluler sing kedadeyan sajrone perkembangan embrio, ndandani jaringan, lan perkembangan kanker. Iki kalebu transformasi sel epitel dadi sel mesenkim, sing nyebabake owah-owahan morfologi sel, motilitas, invasi, lan liya-liyane (Wu et al., 2020). ZEB1 nyegah pirang-pirang penanda epitel, kayata E-cadherin lan Occludin, sing tanggung jawab kanggo njaga adhesi sel-sel lan polaritas sel epitel ing TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Kajaba iku, ZEB1 ngaktifake penanda tartamtu kayata N-cadherin, vimentin lan fibronektin (Konradi et al., 2014) lan uga ngatur gen sing melu remodeling sitoskeletal kayata Rho GTPases lan matriks metalloproteinases (MMP) (Huang). et al., 2014). 2022), saliyane iku, uga mengaruhi macem-macem jalur sinyal kayata transforming growth factor-β (TGF-β), sinyal Wnt, lan liya-liyane, saengga ningkatake invasi tumor lan metastasis ing TNBC (Chen et al., 2016). ). Akeh panliten lan bukti ilmiah sing nuduhake yen ZEB1 nduweni potensi gedhe minangka agen sing terkenal kanggo deteksi lan intervensi terapeutik TNBC. Ing panliten anyar, Waryah et al. nggunakake model TNBC lan entuk penekanan lengkap ZEB1 dening dCas9. Mangkono, dheweke mirsani spesifisitas sing dhuwur banget lan inhibisi ZEB1 sing meh lengkap ing kondisi in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 kuwi piranti panyunting gen sing diarani CRISPR/Cpf1. Iki dijupuk saka sistem CRISPR/Cas, ing ngendi istilah Cas12 nuduhake protein 12 sing ana gandhengane karo CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), sing meh padha karo Cas9. Bedane mung ngandhut protein Cas12. Dibandhingake karo Cas9, Cas12 nduweni sawetara fungsi unik kayata ngasilake ujung sing lengket sajrone proses panyuntingan gen, dene Cas9 ngasilake ujung sing tumpul (Wang et al., 2021). Sifat Cas12 iki nyumbang kanggo teknologi manipulasi DNA spesifik. Minangka protein sing bisa ngenali lan motong DNA target kanthi tepat, nduweni fleksibilitas sing luar biasa, saengga dadi piranti sing efektif kanggo macem-macem aplikasi, kalebu panyuntingan gen (Pickar-Oliver lan Gersbach, 2019).
Kaya varian CRISPR liyane, CRISPR/Cas12 uga bisa nge-knock utawa ngaktifake gen ing TNBC, nargetake gen sing nduweni peran penting ing patogenesis utawa respon marang perawatan (Yang lan Zhang, 2023). Kanggo ngrampungake proses iki, RNA pandhuan (gRNA) dikembangake sing ngarahake Cas12 menyang gen target. Sawise Cas12 kaiket karo target, bakal ngenalake pemecahan untaian ganda ing DNA lan ngaktifake mekanisme ndandani DNA. Sajrone proses ndandani, nukleotida sing salah bisa uga digabungake, sing nyebabake mutasi gen lan ilang fungsi (Zhang et al., 2021a). Kajaba iku, versi enzim Cas12 sing luwih apik (sing diarani dCas12) uga digunakake kanggo ngaktifake gen. Kanthi nggabungake karo aktivator transkripsi, bisa ngindhuksi gen tartamtu, saengga ngaktifake. Teknologi iki nduweni potensi gedhe kanggo ningkatake aktivasi gen penekan tumor (Sultan et al., 2022).
Prime editing iku teknologi editing genom sing nembe dikembangake lan unggul banget. Teknologi iki bisa ngowahi DNA organisme kanthi tepat banget (Chen lan Liu, 2023). Prime editing ditindakake liwat integrasi rong komponen utama: enzim CRISPR/Cas9 sing dimodifikasi lan reverse transcriptase. Perané enzim CRISPR/Cas9 yaiku kanggo milih situs sing tepat ing genom, dene reverse transcriptase mbantu ngowahi DNA kanthi tliti ing lokasi target (Hassan et al., 2021). Ing mekanisme editing primer, langkah pertama yaiku nggawe RNA pandhuan editing primer (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Iki ngemot urutan target lan cithakan RNA sing cocog karo situs editing sing dikarepake ing DNA target. PegRNA banjur dilebokake ing sel target bebarengan karo primer editing nuclease (PE2). PE2 minangka protein fusi sing kasusun saka enzim Cas9, reverse transcriptase, lan adaptor editing primer (Martín-Alonso et al., 2021). Ing njero sel, kompleks pegRNA lan PE2 nggoleki DNA spesifik sing pengin diowahi. Enzim Cas9 ngethok DNA lan nggawe cithakan sing kasusun saka untaian tunggal (Choi et al., 2022). Reverse transcriptase nggunakake cithakan iki kanggo nyiapake DNA kanggo disunting. Bebarengan karo nyalin DNA, pandhuan kanggo nyunting cithakan RNA uga kalebu. Pungkasan, untaian DNA sing mentas digawe digunakake minangka cithakan kanggo ndandani kerusakan ing DNA, sing nyebabake urutan DNA sing diowahi sing ngemot modifikasi sing dikarepake (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mekanisme panyuntingan primer bisa nyebabake mutasi sing nyebar ing gen. Iki bisa nargetake mutasi titik, penyisipan, penghapusan, lan malah panggantos gen (Anzalone et al., 2019; Chen lan Liu, 2023). Panyuntingan utama nawakake sawetara kaluwihan tinimbang teknologi panyuntingan genom sadurunge. Iki kalebu akurasi sing tambah, efek sing ora cocog karo target sing suda, lan kemampuan kanggo nyunting DNA tanpa gumantung ing kerusakan untaian ganda DNA (Anzalone et al., 2020).
Teknologi CRISPR/Cas9 wiwitane dikembangake kanggo nglindhungi bakteri saka transfer plasmid lan infeksi fag lan banjur digunakake maneh minangka alat penargetan DNA berbasis RNA sing efektif kanggo nyunting genom (Jiang lan Doudna, 2017). Kajaba iku, sistem CRISPR/Cas9 wis dilapurake ana ing 50% lan 87% genom bakteri lan archaeal, masing-masing (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 minangka alat potensial kanggo mbusak, nyisipake, lan mbenerake urutan genetik sing ora normal nggunakake mode in vivo lan in vitro (Sabit et al., 2021). Kajaba iku, CRISPR/Cas9 wis dituduhake minangka bagean saka sistem imun adaptif amarga spesifisitas kanggo gen target sing diminati (Chen lan Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 kasusun saka Cas9 lan RNA pandhuan tunggal (sgRNA). Cas9 minangka endonuklease sing kasusun saka pirang-pirang komponen protein. Kajaba iku, Cas9 nduweni sifat struktural lan konformasi sing unik (Pacesa et al., 2022) amarga kasusun saka rong lobus: pangenalan (REC) lan nuklease (NUC). Lobus REC luwih dipérang dadi telung wilayah: REC1, REC2, lan heliks jembatan (Cromwell et al., 2018). NUC kasusun saka telung lobus, yaiku RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH lan domain interaksi motif jejer protospacer (PAM) (Gambar 1) (Song et al., 2016). sgRNA kasusun saka rong komponen, kalebu RNA CRISPR (crRNA) lan transkoding RNA cilik (RNA pelacak) (Gambar 1). sgRNA nyambungake protein Cas9 menyang connexin kanggo mbentuk kompleks aktif, uga dikenal minangka kompleks efektor (Richter et al., 2012). crRNA minangka pasangan basa nukleotida 18-20 sing nduweni peran penting kanggo ngenali urutan DNA target. Kajaba iku, crRNA dipasangake karo DNA target, lan tracrRNA tumindak minangka perancah kanggo Cas9 nuclease kanggo ngiket DNA target (Manghwar et al., 2019). Ing sisih liya, urutan PAM duwe 3 nukleotida, sing ngonfirmasi, nemtokake, lan ngantara pengikatan kompleks efektor menyang DNA. Subunit kompleks protein Cas9 RuvC lan HNH duwe aktivitas katalitik (Richter et al., 2012; Asmamaw lan Zawdie, 2021). Domain HNH nuclease saka subunit Cas9 misahake untaian DNA sing ana gandhengane karo crRNA. Domain nuklease RuvC mbelah untaian DNA liyané lan ngasilaké pemecahan untaian ganda (DSB), sawisé iku rong mekanisme ndandani pemecahan DNA sing béda diaktifaké (Jiang lan Doudna, 2017) (Gambar 1).
Gambar 1. Ringkesan CRISPR/Cas9 (A). Komponen sistem CRISPR/Cas9: (i). Endonuklease Cas9 tanggung jawab kanggo motong urutan DNA target, (ii) RNA pandhuan tunggal (sg) sing diasilake saka gabungan chimera crRNA lan tra-crRNA. (loro). Cas9 kalebu sawetara komponen kayata Rec I, Rec II, lobus NUC (HNH lan Ruv C minangka subkomponen) lan domain interaksi PAM (C) kanthi fungsi sing cocog. Kompleks protein CRISPR/Cas9 mbelah urutan DNA dadi bentuk non-komplementer lan komplementer (D). CRISPR/Cas9 nyunting genom ing telung tahap: pangenalan, motong lan ndandani. sg-RNA sing dirancang nuntun Cas9 lan ngenali urutan sing dikarepake liwat komponen komplementer crRNA. Cas9 ngenali urutan PAM ing 5′-NGG-3′ lan nglelehke DNA, mbentuk hibrida DNA-RNA lan ngaktifake pembelahan. Domain HNH saka Cas9 mbelah untaian komplementer, lan domain RuvC mbelah untaian non-komplementer. CRISPR/Cas9 ndandani dsDNA kanthi mecah kanthi rong cara: non-homolog end joining (NHEJ) lan homology-directed repair (HDR). NHEJ ndandani DNA untaian ganda tanpa ana DNA homolog asing liwat proses enzimatik, mekanisme rawan kesalahan sing bisa nyisipake utawa mbusak urutan DNA acak. HDR iku spesifik banget lan mbutuhake cithakan DNA homolog.
Jalur perbaikan sing dimediasi CRISPR/Cas9 kalebu mekanisme non-homolog end joining (NHEJ) lan mekanisme homology-directed repair (HDR). NHEJ minangka jalur sing rawan kesalahan amarga nglibatake penyisipan utawa penghapusan lan ora mbutuhake pola apa wae sajrone mekanisme perbaikan. NHEJ nggunakake nukleotida acak kanggo ngasilake protein standar (Abbasi et al., 2021). Sistem perbaikan iki kasusun saka patang kompleks kayata kompleks KU, kompleks protein cross-complementing tipe 4 (XRCC-4), enzim pangolahan ujung DNA, lan protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protein kompleks KU duwé rong subunit, Ku 70 lan Ku 80, lan nduwèni peran penting ing mekanisme NHEJ, amarga mekanisme ndandani diwiwiti kanthi pengikatan rong subunit (Ku 70 lan Ku 80) menyang ujung DNA target sing tumpul utawa meh tumpul (Abbasi et al., 2021), sing dadi perancah kanggo ngrekrut faktor liyane sing ana gandhengane karo NHEJ menyang situs cedera (Yang et al., 2020). XRCC-4 lan DNA ligase kasusun saka 334 lan 911 asam amino, lan kompleks XRCC4-DNA ligase IV ngrangsang ligasi ujung DNA (Chatterjee et al., 2015). Enzim pangolahan ujung DNA, uga dikenal minangka polinukleotida kinase 3′-fosfat, minangka enzim pangolahan ujung DNA. Iki bisa mbusak gugus 3′P ing DNA lan ngfosforilasi gugus 5′OH sajrone ndandani DSB. Iki uga nglibatake ndandani pedhot untaian tunggal (SSB) nggunakake jalur ndandani SSB (Chatterjee et al., 2015). Protein kinase DNA-PKcs minangka protein kinase sing gumantung karo DNA sing kasusun saka subunit katalitik saka PIKK (kinase sing ana gandhengane karo phosphatidylinositol 3-kinase) lan kulawarga ataxia telangiectasia mutated (ATM), uga ATR sing ana gandhengane karo ATM lan Rad3. pedhot untaian (DSB) lan pedhot untaian tunggal (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR minangka mekanisme ndandani sing luwih akurat lan cocog amarga informasi kasebut disalin nggunakake wujud utuh saka dupleks DNA homolog, sanajan mbutuhake anané kromatid sadulur. Iki kedadeyan sajrone fase S/G2 saka siklus sel mamalia. HDR utamane kedadeyan ing spesies ragi, nanging NHEJ penting banget ing mamalia (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mekanisme ndandani lengkap dituduhake ing Gambar 1.
Amarga TNBC disebabake dening kelainan genetik lan epigenetik, koreksi kelainan genomik/epigenomik ganas nggunakake CRISPR/Cas9 bisa uga dadi pendekatan terapeutik sing cukup (Chen et al., 2019). Kajaba iku, sawetara faktor transkripsi sing melu regulasi transkripsi spesifik sel bisa uga nuduhake karakteristik unik sel kanker, sing nuduhake yen regulasi transkripsi bisa uga dadi pendekatan sing apik kanggo perawatan kanker (Drost et al., 2017). Ngoptimalake fitur molekuler tumor iki, kayata cacat genetik, epigenetik lan transkripsi, kanggo pangembangan obat bisa nambah asil klinis lan nyuda biaya skrining. CRISPR minangka alat panyuntingan gen potensial sing ora mung bisa ndeteksi lan ngenali target genomik sing nyebabake kanker, nanging uga bisa digunakake kanggo nyunting, nyuda, lan ngowahi onkogen kanthi epigenetik ing sel manungsa (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Sawetara skrining CRISPR wis ditindakake kanggo nggoleki gen sing ana gandhengane karo penekan tumor, onkogen, lan resistensi obat. Panggunaan CRISPR/Cas9 kanggo nyunting macem-macem onkogen TNBC dituduhake ing Gambar 2.
Gambar 2. Suntingan gen saka macem-macem onkogen TNBC nggunakake CRISPR/Cas9 sing nyebabake pertumbuhan tumor lan metastasis sing suda. Onkogen kasebut kalebu CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 lan CXCR7, Crypto1, ROR1 lan ST8SIA, sing melu kedadeyan lan metastasis TNBC.
Migrasi sel kanker, invasi, lan transisi epitel-mesenkim (EMT) ana gandheng cenenge karo ITGA9. Panliten sadurunge nuduhake yen ITGA9 minangka pemain kunci ing jalur Notch lan nduweni peran sing menarik ing metastasis rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Kajaba iku, ITGA9 ditemokake ana gandheng cenenge karo prognosis pasien ing sawetara jinis tumor, kalebu kanker payudara (Wang Z. et al., 2019). Kajaba iku, analisis bioinformatika ITGA9 nuduhake yen ekspresine ing TNBC luwih dhuwur tinimbang subtipe kanker payudara liyane. Tingkat ITGA9 sing dhuwur ana gandheng cenenge karo metastasis tumor lan kambuh ing pasien TNBC. Knockout ITGA9 dening CRISPR/Cas9 nyebabake sifat kaya sel punca kanker (CSC), angiogenesis tumor, pertumbuhan tumor, lan metastasis sing suda kanthi ningkatake degradasi β-catenin ing TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 minangka anggota kulawarga TGF-β lan penting banget kanggo embriogenesis awal, pangopènan sèl punca, lan metastasis kanker (Ishii et al., 2021). Uga dikenal minangka Tdgf-1, iki minangka protein sinyal GPI onkogenik sing melu regulasi pembentukan garis primitif, mesoderm lan endoderm, uga pembentukan asimetri kiwa/tengen ing perkembangan organ awak sajrone embriogenesis (Zhang et al., 2021b). Kajaba iku, Cripto-1 wis dituduhake melu transisi epitel-mesenkim (EMT) minangka penanda sèl punca (Zhang et al., 2021b). EMT penting ora mung kanggo macem-macem proses kayata perkembangan embrio, fibrosis lan penyembuhan luka, nanging uga kanggo invasi kanker lan metastasis. Kajaba iku, Cripto-1 wis dituduhake bisa sesambungan karo papat reseptor Notch lan ningkatake pematangan pasca-translasi (Brandstadter lan Maillard, 2019). Jalur sinyal Notch dikenal melu njaga sel kanker payudara manungsa. Panliten nuduhake yen knockout Crypto-1 sing dimediasi CRISPR/Cas9 nyegah pertumbuhan lan metastasis kanker. Mulane, Crypto-1 bisa dadi target terapeutik sing penting kanggo TNBC (Castro et al., 2015).
Protein XCL12 lan reseptor kemokin CXC (CXCR4 lan CXCR7) nduweni macem-macem peran ing proliferasi, pertumbuhan, migrasi, lan invasi sel kanker (Wu et al., 2015). Kemoreseptor iki wis digandhengake karo perkembangan TNBC liwat pirang-pirang jalur sinyal ing model in vivo lan in vitro (Wu et al., 2015). Kajaba iku, aktivasi CXCR4 lan CXCR7 digandhengake karo kerentanan sing luwih gedhe marang metastasis lan prognosis sing kurang apik ing TNBC (Karn et al., 2022). Mulane, knockout CXCR4 lan CXCR7 bisa dadi gen target obat sing efektif kanggo perawatan kanker payudara, kalebu TNBC. Panliten dening Yang et al. Yang et al (2019) nggunakake CRISPR/Cas9 kanggo ngalahake gen CXCR4 lan CXCR7 lan nemokake manawa proliferasi, pertumbuhan, migrasi, lan invasi TNBC dicegah sacara signifikan (Yang et al., 2019).
Peningkatan tingkat miR-3662, sawijining onkogen TNBC, diamati ing jaringan kanker payudara (Yi et al., 2022). Knockdown miR-3662 wis dituduhake bisa nyegah pertumbuhan tumor kanker payudara lan metastasis ing vivo lan in vitro (Agarwal lan Gupta, 2021). HBP-1 minangka inhibitor kuat sinyal Wnt/-catenin lan kemungkinan tanggung jawab kanggo pertumbuhan sel TNBC sing dimediasi miR-3662. Bubar, Yi et al. nemokake manawa sumbu miR-3662-HBP1 ngatur jalur sinyal Wnt/-catenin ing sel TNBC (Yi et al., 2022). Amarga ekspresi spesifik tumor, miR-3662 bisa dadi target terapi potensial kanggo TNBC. Dadi, knockdown miR-3662 sing dimediasi CRISPR/Cas9 bisa dadi pendekatan sing apik kanggo ngembangake obat anyar kanggo perawatan TNBC.
UBR5 minangka nukleophosphoprotein 300 kDa sing wis diidentifikasi minangka regulator utama tumorigenesis, metastasis, lan respon imun ing macem-macem kanker (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 wis dilapurake duwe regulasi sing dhuwur banget ing sampel TNBC lan ngrangsang fungsi ERα kanthi nyebabake proliferasi liwat aktivitas ligase ubiquitin (Bolt et al., 2015). Panliten sekuensing eksom sakabèhé saka sampel TNBC utama uga nuduhake peningkatan ekspresi UBR5, sing nuduhake perané ing pangembangan TNBC. Kajaba iku, penghapusan UBR5 sing didorong CRISPR/Cas9 nuduhake inhibisi metastasis TNBC sing signifikan lan pertumbuhan ing model tikus eksperimental. Kajaba iku, kalebu UBR5 ing model tikus tipe liar mulihake fungsi lengkap, dene efek iki ora diamati ing galur mutan sing ora aktif (Liao et al., 2017). Kekurangan UBR5 ana gandheng cenenge karo tambahing apoptosis, nekrosis, lan inhibisi pertumbuhan tumor ing TNBC amarga angiogenesis sing kurang. Amarga ilang UBR5, panyebaran tumor menyang organ sing adoh suda, lan UBR5 nyebabake EMT sing ora normal utamane kanthi nyuda ekspresi E-cadherin (Zhang lan Weinberg, 2018). Bubar iki, UBR5 dituduhake minangka faktor sing penting banget ing transkripsi PDL1 sing diinduksi IFN-γ ing TNBC amarga kurang aktivitas ubiquitinasi E3. Analisis transkriptom RNA nuduhake yen UBR5 bisa uga duwe efek sistemik ing gen sing ana gandheng cenenge karo jalur IFN-γ lan ningkatake transaktivasi PDL1 kanthi nambah tingkat aktivasi protein kinase RNA (PKR) lan transduser lan aktivator sinyal. transkripsi 1 (STAT1) lan faktor pengatur interferon 1 (IRF1). Nanging, ablasi gabungan ekspresi UBR5 lan PD-L1 sing dimediasi CRISPR/Cas9 nduweni efek terapeutik sinergis tinimbang blokade wae, kanthi efek sing jero ing lingkungan mikro tumor (Wu et al., 2022). Dadi, CRISPR/Cas9 bisa dadi alat penting kanggo nyegah fungsi UBR5, saengga nyegah metastasis TNBC lan pertumbuhan tumor.
ROR1 minangka protein transmembran tipe I sing diekspresikan sajrone perkembangan kanker lan embrio lan wis diidentifikasi minangka protein onkofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Prilaku invasif saka macem-macem kanker manungsa ana gandhengane karo peningkatan regulasi ROR1. Asil sing njanjeni wis dipikolehi saka panliten in vivo lan in vitro sing nglibatake senyawa terapeutik sing nargetake ROR1 (Chien et al., 2016). Tingkat mRNA ROR1 sing dhuwur ing biopsi jaringan payudara uga wis digandhengake karo tumor payudara kaya basal (BL) sing agresif lan migrasi menyang bagean awak liyane. Kajaba iku, ekspresi ROR1 sing berlebihan wis diidentifikasi minangka penanda prognostik kanggo perkembangan TNBC (Chien et al., 2016). Nanging, ngendhegake ROR1 nggunakake CRISPR/Cas9 kanggo nyegah pertumbuhan lan metastasis TNBC bakal dadi strategi sing efektif.
Proses sialylation nglibatake tambahan asam sialat menyang glikokonjugat, sing dikatalisis dening sialyltransferases (ST). ST8SIA1 kalebu kulawarga ST lan nduweni peran penting ing patogenesis macem-macem penyakit kayata leukemia limfositik lan kanker kolorektal (Chang et al., 2018). Analisis urutan RNA nuduhake yen ST8SIA1 diekspresikan kanthi dhuwur ing jaringan payudara pasien TNBC lan berkorelasi positif karo mutasi ing gen penekan tumor p53, sing bisa nyumbang kanggo patogenesis TNBC (Battula et al., 2017). Kajaba iku, ST8SIA1 melu metastasis lan kambuh maneh TNBC, sing nuduhake yen nduweni peran penting ing kedadeyan lan perkembangan TNBC. Ing model in vitro TNBC, knockdown ST8SIA1 dening CRIPSR/Cas9 dituduhake bisa mblokir pertumbuhan lan metastasis (Battula et al., 2017). Iki nuduhake yen CRISPR/Cas9 bisa uga dadi alat penting kanggo nyegah fungsi onkogen ST8SIA1 ing perawatan TNBC.
NAT1 minangka enzim metabolik sing ngkatalisis pembentukan senyawa xenobiotik fase II lan diekspresikan ing meh kabeh jaringan manungsa. NAT1 bisa nggunakake kofaktor folat kanggo nargetake asetil-CoA (asetil-CoA) sanajan ora ana substrat amina aromatik (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Panliten nuduhake yen NAT1 ngatur fungsi matriks metalloproteinase 9 (MMP9) ing model sel kanker payudara lan nglindhungi saka spesies oksigen reaktif (ROS) sajrone kekurangan glukosa (Wang et al., 2018). Penghapusan NAT1 wis dituduhake bisa nyegah kompleks piruvat dehidrogenase, sing nyebabake disfungsi mitokondria (Wang L. et al., 2019). Kajaba iku, macem-macem laporan liyane nuduhake yen inhibisi NAT1 nggunakake molekul cilik lan pembungkaman siRNA bisa nyuda invasi lan proliferasi sel kanker payudara (Stepp et al., 2018). Bubar iki, CRISPR/Cas9 digunakake kanggo nyuda NAT1 ing garis sel kanker payudara MDA-MB-231, sing mengaruhi metabolisme seluler gumantung saka tingkat ekspresine. Panliten iki uga nuduhake yen NAT-1 penting banget kanggo perkembangan lan metastasis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkripsi onkogen sing terkoordinasi diatur dening super enhancer, faktor transkripsi, lan kofaktor (Hnisz et al., 2015). Kajaba iku, sakelompok kinase sing gumantung karo siklin (CDK), kayata CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, lan CDK13, dibutuhake kanggo regulasi transkripsi. Antarane, CDK7 melu ing fosforilasi RNA polimerase II, sing penting banget kanggo inisiasi lan ekspansi transkripsi onkogen ing patogenesis TNBC. Ing panliten seminal, delesi CDK7 dening CRISPR/Cas9 nyegah TNBC, sing nuduhake yen patogenesis TNBC gumantung karo CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Panliten nuduhake yen mutasi ing MYC lan RBP (protein pengikat RNA) bisa nyebabake apoptosis, dene mutasi gen tunggal ing MYC utawa RBP ora mengaruhi tuwuhing sel kanker (Einstein et al., 2021). Luwih saka 1000 RBP ing genom manungsa wis disaring nggunakake perpustakaan berbasis CRISPR/Cas9. Antarane, 57 RBP ditemokake penting kanggo tuwuhing sel kanker kanthi tingkat MYC sing dhuwur banget (Wheeler et al., 2020). Kajaba iku, YTHDF2 penting kanggo njaga tuwuhing sel TNBC lan nyuda jumlah transkrip termetilasi sajrone transkripsi lan terjemahan tingkat dhuwur ing sel kanker kanthi ekspresi MYC sing luwih dhuwur. Kajaba iku, YTHDF2 ora penting kanggo sel kanker, sing kurang gumantung ing tingkat MYC sing dhuwur kanggo ndawakake kaslametan pasien TNBC (Einstein et al., 2021), sing nuduhake yen bisa uga dadi target terapi potensial kanggo obat sing bisa ngatasi TNBC.
Protein driji seng (ZNF) nyusun kira-kira 1% saka total genom manungsa. Panliten nuduhake yen ZNF bisa ngatur proliferasi sel ing macem-macem kanker, kayata kanker ati, kanker payudara lan kanker kolorektal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Pustaka sing digawe dening knockout CRISPR wis digunakake kanggo nyaring macem-macem gen penekan tumor (TSG) ing sel kanker payudara (Shalem et al., 2014). Wiwit kuwi, panliten transkriptomik sel kanker payudara sing dibusak CRISPR/Cas9 ZNF319 nuduhake yen ZNF319 minangka gen penekan tumor sing nyuda proliferasi kanker payudara lan mulane melu macem-macem mekanisme sinyal potensial lan fungsi biologis liyane (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosis minangka jinis pati sel sing diprogram sing gumantung marang anané wesi. Dikenal manawa perkembangan ferroptosis dipengaruhi dening anané peroksida lipid. Kajaba iku, PKCβII wis dilapurake nuduhake peroksidasi lipid awal, lan peningkatan peroksidasi lipid ana gandhengane karo ferroptosis. Skrining perpustakaan inhibitor kinase sing dimediasi CRISPR/Cas9 nuduhake manawa PKCβII melu proses peroksidasi lipid, sing penting kanggo ferroptosis ing sel MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Mulane, iki nuduhake manawa knockout PKCβII dening CRISPR/Cas9 bisa uga dadi target gen penekan tumor potensial kanggo perawatan penyakit sing ana gandhengane karo ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Resistensi obat diyakini tanggung jawab kanggo kira-kira 90% kematian ing pasien kanker lan minangka salah sawijining tantangan utama ing perawatan kanker (Bukowski et al., 2020). Asil kasebut nuduhake manawa jumlah gen sing cukup sing ana gandhengane karo efluks obat, ndandani DNA, apoptosis lan macem-macem jalur sinyal sel ana gandhengane karo resistensi obat (Haider et al., 2020). Antarane, sawetara gen wis dadi target alat CRISPR/Cas9 lan wis nuduhake asil sing janjeni kanggo nyuda resistensi obat lan nambah efektifitas perawatan anti-kanker (Vaghari-Tabari et al., 2022). Kajaba iku, perpustakaan skrining knockout gen CRISPR/Cas9 kanthi throughput dhuwur wis terlibat ing modifikasi fungsi target gen resistensi obat potensial (Shalem et al., 2015). Kanggo ngenali gen resistensi paclitaxel, sekuensing RNA sing digabungake karo skrining perpustakaan sgRNA sak genom digunakake kanggo ngenali wolung gen kandidat, kalebu histone deacetylase 9 (HDAC9), sing ana gandhengane karo resistensi obat ing pasien TNBC sing kambuh (B et al., 2020). Ing panliten liyane, tambah akeh ekspresi diserine/treonine lan tirosin protein kinase (DSTYK) diamati sajrone kaslametan pasien TNBC sing diobati nganggo obat antikanker. Kajaba iku, knockdown DSTYK sing dimediasi CRISPR/Cas9 sacara signifikan ningkatake apoptosis sel kanker sing tahan obat in vitro (sel SUM102PT lan sel MDA-MB-468) lan model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Senajan TNBC nduweni aktivasi jalur MAPK sing ora normal, efek klinis saka terapi sing ditargetake MEK kurang apik. Layar pustaka genomik CRISPR/Cas9 nuduhake yen inhibisi PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) ndadekake sel TNBC BT549 lan MB468 dadi sensitisasi marang inhibitor MEK AZD6244. Penurunan CRISPR/Cas9 saka PSMG2 ngowahi fungsi proteasome normal, sing nyebabake pembongkaran PDPK1 sing dimediasi autophagy, saengga luwih ningkatake sel tumor ing model tikus TNBC sing diinduksi dening AZD6244 (MEK inhibitor) lan MG132 (proteasome inhibitor). Mangkono, inhibitor proteasome lan MAP kinase (MEK) bisa diwenehake kanthi sinergis kanggo nyuda proliferasi sel tumor (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 uga wis digunakake kanggo nyaring ilang fungsi gen sing nyebabake resistensi TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al nerangake mekanisme resistensi obat sel kanker sing diobati nganggo JQ1, inhibitor bromodomain BET (BBDI), ing TNBC. Nggunakake CRISPR/Cas9, dheweke nemokake yen mbusak gen rb1 nyebabake TNBC dadi resisten marang obat anti-kanker JQ1. Mulane, fungsi rb1 penting kanggo nanggepi obat JQ1 ing TNBC. Dheweke uga nglaporake yen paclitaxel minangka inhibitor CDK4/6 kinase/mikrotubulus, lan kombinasi karo BBDI kayata JQ1 bisa menehi respon terapeutik sing njanjeni kanggo TNBC sing resisten obat (Ge et al., 2020).
Lanskap transkripsi RNA noncoding dawa (lncRNA) wis dilapurake tanggung jawab kanggo resistensi marang terapi neoadjuvant ing TNBC. Panliten iki nuduhake yen limang transkrip lncRNA MALAT1 sing beda diekspresikan kanthi dhuwur ing TNBC. Kajaba iku, delesi MALAT1 sing dimediasi CRISPR/Cas9 nambah sensitivitas sel TNBC BT-549 marang paclitaxel lan doxorubicin, sing nuduhake peran potensial kanggo resistensi MALAT1 ing TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutasi ing BRCA1 (BRCA1m) iku heterogen lan mulane angel dideteksi. Narget PARP1 (poli(ADP-ribose) polimerase), mitra mematikan sintetis BRCA1, bisa nambah kemosensitivitas obat TNBC. Nggunakake CRISPR/Cas9, delesi PARP1 nambah sensitivitas obat antikanker kayata doxorubicin, gemcitabine lan docetaxel marang sel TNBC mutan mBRCA1, sing nuduhake yen PARP1 uga melu resistensi obat ing TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutasi ing gen penekan tumor BRCA1 utawa BRCA2 dikenal bisa nambah kemungkinan ngembangake kanker payudara ing wong. Perawatan pasien kasebut mbutuhake panggunaan inhibitor PARP. Kajaba iku, wis dibuktekake manawa knockout saka faktor penyelamat nukleotida DNPH1 nggunakake CRISPR/Cas9 bisa mbusak nukleotida 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat beracun, saengga nambah respon sel sing kekurangan BRCA marang sensitivitas marang inhibitor PARP (Fugger). et al., 2021). Mangkono, inhibitor CRISPR/Cas9 lan PARP1 bisa dadi strategi perawatan sing penting kanggo TNBC.
Gen glikoprotein penetran (P-gp) minangka gen resistensi multiobat sing umume diregulasi ing kira-kira 41% saka kabeh TNBC (Sun et al., 2020). Aliran obat sing diinduksi P-gp wis diidentifikasi minangka regulator utama resistensi obat ing kanker payudara. Inhibitor P-gp wis nduduhake peningkatan sensitivitas marang obat antikanker ing kanker payudara (Famta et al., 2021). Dadi, ablasi utawa penekanan inhibitor P-gp lan P-gp sing dimediasi CRISPR/Cas9 bisa dadi cara sing penting banget kanggo ngatasi resistensi obat ing TNBC.
Transporter kaset pengikat ATP G2 (ABCG2) dikenal nyebabake resistensi obat ing TNBC (Palasuberniam et al., 2015), sanajan saiki durung ana laporan babagan hubungan antarane pembungkaman CRISPR/Cas9 lan ABCG2 lan inaktivasi gen penekan tumor. PTEN Bisa nambah aktivasi ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Mulane, nggunakake CRISP/Ca9 kanggo mbusak ABCG2 lan nggabungake karo inhibitor ABCG2 bisa dadi perawatan sing cocog kanggo ngatasi resistensi obat ing TNBC. Tabel 2 nyebutake CRISPR/Cas9 sing nargetake kabeh gen resistensi.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 nargetake macem-macem gen resistensi TNBC kanggo nggawe sel luwih sensitif marang obat antikanker.
Pustaka CRISPR/Cas9 minangka piranti potensial kanggo nyaring mutasi gen sing ana gandhengane karo patogenesis kanker (Chan et al., 2022). Metode skrining iki nglibatake patang langkah kayata (a) konstruksi perpustakaan, (b) transduksi lentiviral, (c) skrining fenotipik, lan (d) analisis gen target. Sanajan TNBC duwe aktivasi jalur MAPK sing ora normal, prognosis klinis terapi target MEK kanggo pasien TNBC sing nggawa mutasi ing gen penekan tumor kayata PTEN, RB1, lan TP53 kurang apik.
Kajaba iku, skrining knockout gen nggunakake CRISPR/Cas9 nguji molekul sing paling kuat lan selektif, dehydrocatrol, sing akeh ditemokake ing ekstrak kembang lan godhong Guatemala, kanggo mangerteni efek dehydrocatrol ing MDA-MB-231. Mekanisme sitotoksisitas sel selektif. Karakteristik stemness mesenchymal saka subtipe TNBC. Skrin adhedhasar CRISPR/Cas9 iki uga nuduhake yen HSD17B11, gen sing ngode 17β-hydroxysteroid dehydrogenase tipe 11, diekspresikan kanthi dhuwur ing sel MDA-MB-231 lan nyebabake dehidrofalcarinol khusus kanggo sel MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Dadi, iki nuduhake yen skrining genomik CRISPR/Cas9 duwe potensi gedhe kanggo ngenali mekanisme sing ndasari sifat antikanker saka senyawa alami potensial.
Kajaba iku, kerentanan TNBC marang kanker ditliti nggunakake layar CRISPR/Cas9 in vivo genom sing ora bias, sing nuduhake hubungan antarane jalur onkogenik lan supresor tumor. Komponen kunci jalur mTOR lan Hippo wis dilaporake nduweni peran penting ing regulasi tumor ing TNBC. Kajaba iku, panliten nuduhake yen inhibisi farmakologis mTORC1/2 lan onkoprotein YAP kanthi efektif nyegah patogenisitas TNBC nggunakake model sinergi matriks obat in vitro lan xenograft sing diturunake pasien in vivo. Kajaba iku, inhibisi mTORC1/2 sing dimediasi Torin-1 nambah makropinositosis, dene inhibisi YAP sing diinduksi verteporfin nyebabake pati sel TNBC. Digabungake, asil kasebut nyoroti kekuwatan lan kekuwatan skrining CRISPR in vivo genom kanggo ngenali perawatan anyar lan efektif kanggo TNBC (Dai et al., 2021).
Disregulasi sistem kekebalan awak minangka faktor penting ing tumorigenesis. Sel kanker ngindhari pembersihan kekebalan awak kanthi ngliwati mekanisme pertahanan, kalebu ngganggu aktivitas sel kekebalan awak ing lingkungan mikro tumor lan ngrusak sistem kekebalan awak. Mulane, ngembangake sistem kekebalan awak sing luwih apik bisa dadi pendekatan kunci kanggo nglawan tumor. Panggunaan modifikasi gen adhedhasar CRISPR/Cas9 ngatasi sawetara masalah sing ana gandhengane karo disfungsi kekebalan awak saka macem-macem perspektif. CRISPR/Cas9 wis digunakake kanggo ningkatake kekebalan antitumor nglawan kanker payudara liwat jalur ing ngisor iki (Gambar 3).
Gambar 3. Imunoterapi CRISPR/Cas9 nargetake sel TNBC. Ilange CDK5 lan knockdown PDL1 lan CD155 ningkatake sistem kekebalan awak. Semono uga, ilange A2AR lan knockdown TAA kayata HER2, mucin 1 lan TEM8 nambah efisiensi sel CAR-T kanggo mateni sel kanker. Skrining sel T sing didorong CRISPR/Cas9 nuduhake yen gangguan p38 kinase nambah aktivitas antitumor sel T. Sel T sing dimodifikasi dening CRISPR/Cas9 nambah ekspresi TCR (reseptor sel T), sing nyebabake sel T duwe aktivitas antitumor.
Tujuan saka imunoterapi yaiku kanggo ngrangsang sistem kekebalan awak supaya nyerang sel kanker. Ekspresi protein checkpoint kekebalan sing berlebihan biasane nyegah reaksi autoimun nanging bisa mbantu kanker supaya ora kena reaksi kasebut (Topalian et al., 2015). Protein kasebut nyegah reaksi kekebalan awak kanthi naleni reseptor ing permukaan sel kekebalan awak. Protein checkpoint ganda (kayata CD155 lan PD-L1) nargetake reseptor PD-1 ing sel kekebalan awak lan diekspresikan ing kanker payudara, utamane TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Knockdown PD-L1 utawa reseptore nggunakake CRISPR/Cas9 bisa ngrangsang sistem kekebalan awak supaya nyerang tumor TNBC (Yahata et al., 2019). Kajaba iku, downregulation ekspresi PD-L1 liwat delesi CDK5 sing dimediasi CRISPR/Cas9 wis dituduhake bisa nyegah pertumbuhan tumor in vitro lan in vivo (Deng et al., 2020). Inhibisi pertumbuhan ing model kanker payudara in vitro lan in vivo nuduhake yen reduksi CD155 sing dimediasi shRNA bisa uga duwe efek terapeutik ing kanker payudara (Gao et al., 2018).
Sel T CAR ngekspresikake CAR sing ngenali antigen sing ana gandhengane karo tumor (TAA) lan bisa nggunakake knockdown protein checkpoint kanggo nambah aktivitase (Li C. et al., 2020). Ana macem-macem target potensial kanggo terapi sel T CAR ing kanker payudara, kalebu sawetara TAA kayata HER2, mucin1, lan TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ana bukti yen sel T CAR sing nargetake mesothelin (overexpressed ing sel TNBC BT-459) luwih efektif nglawan kanker nalika PD-1 diilangi nggunakake CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Nanging, ngisolasi sel T saka pasien banjur nyunting ex vivo minangka proses sing mbutuhake tenaga lan wektu akeh. Sanajan sel T universal bisa nyuda syarat isolasi, sel T donor sing ngekspresikake antigen leukosit manungsa (HLA) kelas I lan reseptor sel T (TCR) kudu dicopot kanggo nyegah kelainan graft-versus-host (Ren et al., 2017). , 2017a). Nggunakake CRISPR/Cas9, HDR bisa ngilangi TCR lan HLA kanthi bebarengan lan ngilangake gen sing ngode CAR. Panliten nuduhake yen CRISPR/Cas9 bisa digunakake kanggo ngenalake CAR anti-CD19 menyang lokus TCR, saengga ngasilake CAR kanthi efisien tanpa ngrusak sel T (Dimitri et al., 2022). Teknologi multipleks wis dikembangake kanggo ngasilake sel T CAR alogenik kanthi bebarengan ngilangi TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), subunit HLA-I lan protein liyane kayata PD-1 lan CTLA-4, sing bisa uga duwe sifat anti-kanker sing luwih gedhe. nglawan TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Nggunakake CRISPR/Cas9 bisa ningkatake efektifitas sel CAR-T. Adenosin dikenal nduweni sipat imunosupresif lan bisa nyuda kekebalan antikanker kanthi mblokir fungsi sel T lan ngaktifake reseptor adenosin A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Ngrendhem A2AR nggunakake CRISPR/Cas9 kanthi signifikan ningkatake efektifitas sel CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Sel T dikenal nduweni macem-macem karakteristik fenotipik kayata ekspansi seluler, diferensiasi, stres oksidatif lan stres genomik. Skrining sel T berbasis CRISPR/Cas9 nuduhake gangguan 25 reseptor kinase sel T sing beda. Antarane, penghapusan p38 kinase wis dituduhake bisa ningkatake aktivitas antitumor sel T, sing nuduhake yen p38 kinase minangka regulator utama regulasi sel CAR-T (Gurasamy et al., 2020).
Sel T bisa dimodifikasi sacara genetis nggunakake CRISPR/Cas9 kanggo ngasilake TCR sing diekspresikan kanthi dhuwur. Transfer sel T sing dimodifikasi sacara genetis menyang pasien wis nuduhake aktivitas antikanker sing luwih kuwat tinimbang sel T endogen. Mulane, TCR endogen bisa saingan karo TCR sing dimodifikasi sacara genetis ing pasien, sing bisa mengaruhi potensi imunoterapi kanker. Kanggo ngatasi masalah iki, nggunakake CRISPR/Cas9 kanggo mbusak TCR-β endogen ing sel panampa lan banjur transfer sel T TCR-β menyang pasien kanker bisa nuduhake respon imun antikanker sing luwih apik tanpa perlu kompetisi seksual TCR endogen (Fan et al. 2018). Dadi, kajaba sel T sing dimodifikasi CRISPR, TCR sewu kali luwih sensitif marang antigen tumor tinimbang sel T sing ditransduksi TCR normal. Kajaba iku, ing macem-macem leukemia, sel T sing dimodifikasi sing diasilake dening γδ TCR+ CRISPR nuduhake ekspresi sel T CD4+ lan CD8+ sing luwih dhuwur tinimbang transfer TCR standar (Legut et al., 2018). Dadi, sèl T sing dimodifikasi sing diasilake déning CRISPR/Cas9 bisa dadi metode imunoterapi sing efektif kanggo ngatasi TNBC.
Integrin iku molekul adhesi sel sing ana ing transmembran seluler lan ningkatake pengikatan sel menyang matriks ekstraseluler (ECM) (Hamidi lan Ivaska, 2018). Disregulasi integrin ana gandhengane karo perkembangan lan migrasi kanker kanthi ngowahi matriks ekstraseluler, sing nyebabake kelangsungan urip sel kanker ing sirkulasi (Hamidi lan Ivaska, 2018). Knockdown integrin sing dimediasi CRISPR/Cas9 ngalangi perkembangan tumor, metastasis, lan kolonisasi ing TNBC. Knockdown integrin a5 (ITGA5) wis dilaporake bisa nyuda migrasi lan perkembangan sel ing kanker liyane kayata kanker paru-paru (Ju et al., 2017), sing nuduhake yen integrin a5 uga bisa dadi faktor kunci ing patogenesis TNBC.
Ngasilake tikus knockout nggunakake metode sel punca embrio (ES) tradisional minangka proses sing mbutuhake tenaga kerja sing akeh, mbutuhake wektu, lan ora efisien. Butuh pirang-pirang wulan lan pirang-pirang taun kanggo nargetake sel ES liwat rekombinasi homolog, ngembangbiakake tikus kimerik, banjur nyilangake karo tikus heterozigot kanggo ngasilake keturunan homozigot. Kawin silang sing kompleks dibutuhake kanggo nggawe tikus kanthi pirang-pirang mutasi genetik. Nanging, akeh masalah sing muncul nalika nggunakake tikus sing diasilake dening ablasi sel ES nggunakake CRISPR/Cas9 utawa kanthi nyuntikake komponen CRISPR/Cas9 menyang endhog sing dibuahi sel tunggal. Contone, introduksi owah-owahan asring kedadeyan ing lokus biallelik lan ora spesifik gen. Bubar dilapurake yen sel ES sing nggunakake teknologi CRISPR/Cas9 bisa nyisipake mutasi biallelik kanthi bebarengan ing nganti 5 gen (Nishizono et al., 2021). Kanggo tujuan iki, mRNA Cas9 lan limang gRNA spesifik gen ditransfeksi kanthi bebarengan menyang sel ES. Iki nyoroti janji lan efektifitas prosedur iki, sanajan mutasi kasebut bisa uga diturunake nalika garis pendiri dikembangbiakan kanggo ngasilake tikus knockout quintuple. Panliten kasebut uga nglaporake panemuan sing nggumunake: Sel ES ora dibutuhake maneh kanggo nggawe tikus sing dimodifikasi sacara genetis. Nanging, kanggo mbusak produk gen tartamtu, mRNA Cas9 lan gRNA disuntikake menyang embrio tahap sel tunggal. Akibate, garis pendiri knockout wis digawe sing sacara teoritis bisa digunakake kanggo nyinaoni akibat saka pambusakan gen ing tikus (Qin et al., 2016). Mangkono, CRISPR/Cas9 ngidini nggawe tikus transgenik kanggo nambani TNBC kanthi biaya sing luwih murah tinimbang rekayasa genetik tradisional. Nggunakake sistem CRISPR/Cas, model tikus knockout anyar wis dikembangake sing bisa sukses ngenalake mutasi titik ing siji utawa luwih gen endogen ing TNBC. Adhedhasar konsep iki, model kewan TNBC uga bisa dikembangake nggunakake delesi BRCA1 lan p53 sing dimediasi CRISPR/Cas9, sing nyebabake ilang perbaikan HR, ketidakstabilan genomik, lan fenotipe mutan (Annunziato et al., 2020).
Saiki, macem-macem cara kaya mamografi, pencitraan resonansi magnetik (MRI) lan ultrasonografi digunakake kanggo diagnosa TNBC. Nanging, cara-cara kasebut nduweni sawetara watesan. Mamografi digunakake kanggo diagnosa jaringan payudara lokal tinimbang metastasis, ing ngendi sel kanker wis migrasi menyang organ liyane. Ultrasonografi dudu cara sing bisa dipercaya kanggo diagnosa TNBC (Chen lan Lee-Felker, 2023). MRI nduweni sensitivitas sing luwih dhuwur tinimbang ultrasonografi lan mamografi, nanging akurasi diagnostike winates (Sha lan Chen, 2022). Biopsi jaringan minangka cara invasif kanggo ngenali sel kanker. Nanging, ing sawetara kasus, biopsi bisa uga ora nemokake jaringan kanker yen jarum nyimpang saka area sing diminati. Kajaba iku, larang banget lan bisa dadi traumatis kanggo pasien. TNBC minangka jinis kanker sing heterogen, mula biopsi bisa uga ora menehi informasi sing cukup babagan jinis kanker. Mulane, cara diagnostik sing dipercaya anyar kanggo ndeteksi TNBC dibutuhake banget. CRISPR/Cas9 bisa dadi alternatif sing sensitif banget lan minimal invasif kanggo diagnosis kanker payudara. Kanggo tujuan iki, strategi adhedhasar CRISPR/Cas9 bisa digunakake kanggo ningkatake metode PCR kanggo diagnosis TNBC. Kapisan, protein Cas9 lan cpf1 saka sistem CRISPR digunakake kanggo mbusak DNA non-spesifik, banjur loro protein iki (Cas9 lan cpf1) bisa ngenali urutan PAM sadurunge naleni menyang DNA target (Deepak Singh et al., 2021). Kanthi mangkono, PCR bisa ngenali mutasi sing ana gandhengane karo perkembangan kanker. Sawetara panliten wis nggunakake strategi adhedhasar CRISPR iki kanggo ndeteksi mutasi sing beda ing kanker sing beda (Safari et al., 2019). Kanthi mangkono, metode PCR adhedhasar CRISPR bisa nyuda katergantungan diagnosis TNBC marang metode invasif kayata imunohistokimia adhedhasar biopsi.
Owah-owahan genotipik ing regulasi reseptor hormon uga wis dituduhake ing TNBC (Chen lan Russo, 2009). Strategi PCR berbasis CRISPR/Cas9 sing nggunakake microarray kanggo diagnostik point-of-care bisa kanthi efektif ngawasi mutasi kasebut (Hajian et al., 2019). Iki uga bisa nyedhiyakake informasi sing relevan babagan mutasi tartamtu ing pasien TNBC kanggo panyedhiya layanan kesehatan, sing bisa mbantu ningkatake proses perawatan. Nanging, teknik gabungan iki nduweni watesan. Mulane, upaya riset ekstensif dibutuhake sadurunge metode CRISPR/Cas-PCR iki bisa digunakake ing layanan kesehatan kanggo diagnosis TNBC (Yang et al., 2019).