Diagnosis banding nodul paru sing diidentifikasi nganggo tomografi komputer (CT) tetep dadi tantangan ing praktik klinis. Ing kene, kita njlentrehake metabolit global saka 480 sampel serum, kalebu kontrol sehat, nodul paru jinak, lan adenokarsinoma paru stadium I. Adenokarsinoma nuduhake profil metabolomik sing unik, dene nodul jinak lan individu sehat duwe kamiripan sing dhuwur ing profil metabolomik. Ing klompok panemuan (n = 306), sakumpulan 27 metabolit diidentifikasi kanggo mbedakake antarane nodul jinak lan ganas. AUC saka model diskriminan ing validasi internal (n = 104) lan validasi eksternal (n = 111) yaiku 0,915 lan 0,945. Analisis jalur nuduhake peningkatan metabolit glikolitik sing ana gandhengane karo penurunan triptofan ing serum adenokarsinoma paru dibandhingake karo nodul jinak lan kontrol sehat, lan menehi saran manawa serapan triptofan ningkatake glikolisis ing sel kanker paru-paru. Panliten kita nyoroti nilai biomarker metabolit serum kanggo netepake risiko nodul paru-paru sing dideteksi nganggo CT.
Diagnosis awal iku penting banget kanggo ningkatake tingkat kaslametan kanggo pasien kanker. Asil saka US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) lan European NELSON Study nuduhake yen skrining nganggo computed tomography dosis rendah (LDCT) bisa nyuda angka kematian kanker paru-paru kanthi signifikan ing klompok risiko dhuwur1,2,3. Wiwit panggunaan LDCT sing nyebar kanggo skrining kanker paru-paru, kedadeyan temuan radiografi insidental nodul paru asimtomatik terus mundhak4. Nodul paru ditegesake minangka opasitas fokal nganti diameter 3 cm5. Kita ngadhepi kesulitan kanggo netepake kemungkinan keganasan lan nangani akeh nodul paru sing dideteksi kanthi ora sengaja ing LDCT. Watesan CT bisa nyebabake pemeriksaan tindak lanjut sing kerep lan asil positif palsu, sing nyebabake intervensi lan perawatan sing ora perlu6. Mulane, ana kebutuhan kanggo ngembangake biomarker sing dipercaya lan migunani kanggo ngenali kanker paru-paru kanthi bener ing tahap awal lan mbedakake umume nodul jinak ing deteksi awal7.
Analisis molekuler getih sing komprehensif (serum, plasma, sel mononuklear getih perifer), kalebu genomik, proteomik utawa metilasi DNA8,9,10, wis nyebabake minat sing saya tambah ing panemuan biomarker diagnostik kanggo kanker paru-paru. Sauntara kuwi, pendekatan metabolomik ngukur produk pungkasan seluler sing dipengaruhi dening tumindak endogen lan eksogen lan mulane ditrapake kanggo prédhiksi wiwitan lan asil penyakit. Spektrometri massa kromatografi cair-tandem (LC-MS) minangka metode sing akeh digunakake kanggo studi metabolomik amarga sensitivitas sing dhuwur lan rentang dinamis sing gedhe, sing bisa nutupi metabolit kanthi sifat fisikokimia sing beda11,12,13. Sanajan analisis metabolomik global plasma/serum wis digunakake kanggo ngenali biomarker sing ana gandhengane karo diagnosis kanker paru-paru14,15,16,17 lan efektifitas perawatan,18 pengklasifikasi metabolit serum kanggo mbedakake antarane nodul paru-paru jinak lan ganas isih akeh ditliti. -riset gedhe.
Adenokarsinoma lan karsinoma sel skuamosa minangka rong subtipe utama kanker paru-paru non-sel cilik (NSCLC). Macem-macem tes skrining CT nuduhake yen adenokarsinoma minangka jinis histologis kanker paru-paru sing paling umum1,19,20,21. Ing panliten iki, kita nggunakake spektrometri massa resolusi dhuwur kromatografi cair ultra-kinerja (UPLC-HRMS) kanggo nindakake analisis metabolomik ing total 695 sampel serum, kalebu kontrol sehat, nodul paru jinak, lan ≤3 cm sing dideteksi CT. Skrining kanggo adenokarsinoma paru-paru Tahap I. Kita ngidentifikasi panel metabolit serum sing mbedakake adenokarsinoma paru-paru saka nodul jinak lan kontrol sehat. Analisis pengayaan jalur nuduhake yen metabolisme triptofan lan glukosa sing ora normal minangka owah-owahan umum ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo nodul jinak lan kontrol sehat. Pungkasan, kita netepake lan validasi klasifikasi metabolik serum kanthi spesifisitas lan sensitivitas sing dhuwur kanggo mbedakake antarane nodul paru ganas lan jinak sing dideteksi dening LDCT, sing bisa mbantu diagnosis diferensial awal lan penilaian risiko.
Ing panliten saiki, sampel serum sing cocog karo jenis kelamin lan umur dikumpulake kanthi retrospektif saka 174 kontrol sehat, 292 pasien kanthi nodul paru jinak, lan 229 pasien kanthi adenokarsinoma paru stadium I. Karakteristik demografi saka 695 subjek dituduhake ing Tabel Tambahan 1.
Kaya sing dituduhake ing Gambar 1a, total 480 sampel serum, kalebu 174 kontrol sehat (HC), 170 nodul jinak (BN), lan 136 sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) stadium I, dikumpulake ing Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Kohort panemuan kanggo profil metabolomik sing ora ditarget nggunakake spektrometri massa kromatografi cair kinerja ultra-tinggi (UPLC-HRMS). Kaya sing dituduhake ing Gambar Tambahan 1, metabolit diferensial antarane LA lan HC, LA lan BN diidentifikasi kanggo netepake model klasifikasi lan luwih njelajah analisis jalur diferensial. 104 sampel sing dikumpulake dening Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen lan 111 sampel sing dikumpulake dening rong rumah sakit liyane ditindakake validasi internal lan eksternal.
a Populasi panliten ing kohort panemuan sing ngalami analisis metabolomik serum global nggunakake kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa resolusi dhuwur (UPLC-HRMS). b Analisis diskriminan kuadrat paling cilik parsial (PLS-DA) saka total metabolit saka 480 sampel serum saka kohort panliten, kalebu kontrol sehat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), lan adenokarsinoma paru stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mode ionisasi elektrospray positif, -ESI, mode ionisasi elektrospray negatif. c–e Metabolit kanthi jumlah sing beda banget ing rong klompok sing diwenehake (tes peringkat Wilcoxon rong buntut, nilai p sing disesuaikan karo tingkat panemuan palsu, FDR <0,05) dituduhake kanthi warna abang (owah-owahan lipatan > 1,2) lan biru (owah-owahan lipatan < 0,83). ) dituduhake ing grafik gunung geni. Peta panas kluster hierarkis sing nuduhake bedane sing signifikan ing jumlah metabolit sing diwenehi anotasi antarane LA lan BN. Data sumber diwenehake ing wangun file data sumber.
Total metabolit serum saka 174 HC, 170 BN lan 136 LA ing klompok panemuan dianalisis nggunakake analisis UPLC-HRMS. Kita pisanan nuduhake yen sampel kontrol kualitas (QC) kluster rapet ing tengah model analisis komponen utama (PCA) sing ora diawasi, sing ngonfirmasi stabilitas kinerja panliten saiki (Gambar Tambahan 2).
Kaya sing dituduhake ing analisis diskriminan kuadrat paling cilik parsial (PLS-DA) ing Gambar 1 b, kita nemokake manawa ana bedane sing jelas antarane LA lan BN, LA lan HC ing mode ionisasi elektrospray positif (+ESI) lan negatif (−ESI) sing diisolasi. Nanging, ora ana bedane sing signifikan antarane BN lan HC ing kondisi +ESI lan -ESI.
Kita nemokake 382 fitur diferensial antarane LA lan HC, 231 fitur diferensial antarane LA lan BN, lan 95 fitur diferensial antarane BN lan HC (uji peringkat Wilcoxon, FDR <0,05 lan owah-owahan kaping pirang-pirang >1,2 utawa <0,83) (Gambar .1c-e). Puncak luwih lanjut dianotasi (Data Tambahan 3) marang basis data (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) miturut nilai m/z, wektu retensi lan panelusuran spektrum massa fragmentasi (rincian diterangake ing bagean Metode) 22. Pungkasan, 33 lan 38 metabolit sing dianotasi kanthi beda sing signifikan ing kelimpahan diidentifikasi kanggo LA versus BN (Gambar 1f lan Tabel Tambahan 2) lan LA versus HC (Gambar Tambahan 3 lan Tabel Tambahan 2). Kosok baline, mung 3 metabolit kanthi beda sing signifikan ing kelimpahan sing diidentifikasi ing BN lan HC (Tabel Tambahan 2), konsisten karo tumpang tindih antarane BN lan HC ing PLS-DA. Metabolit diferensial iki nyakup macem-macem biokimia (Gambar Tambahan 4). Dijupuk bebarengan, asil iki nuduhake owah-owahan sing signifikan ing metabolit serum sing nggambarake transformasi ganas kanker paru-paru tahap awal dibandhingake karo nodul paru-paru jinak utawa subjek sing sehat. Sauntara kuwi, kamiripan metabolit serum BN lan HC nuduhake yen nodul paru jinak bisa nuduhake akeh karakteristik biologis karo individu sing sehat. Amarga mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) umum ing subtipe adenokarsinoma paru-paru 23, kita ngupaya nemtokake dampak mutasi driver ing metabolit serum. Kita banjur nganalisa profil metabolomik sakabèhé saka 72 kasus kanthi status EGFR ing klompok adenokarsinoma paru-paru. Menariknya, kita nemokake profil sing bisa dibandhingake antarane pasien mutan EGFR (n = 41) lan pasien tipe liar EGFR (n = 31) ing analisis PCA (Gambar Tambahan 5a). Nanging, kita ngidentifikasi 7 metabolit sing jumlahe owah sacara signifikan ing pasien kanthi mutasi EGFR dibandhingake karo pasien kanthi EGFR tipe liar (uji t, p <0,05 lan owah-owahan lipatan > 1,2 utawa <0,83) (Gambar Tambahan 5b). Mayoritas metabolit kasebut (5 saka 7) yaiku asilkarnitin, sing nduweni peran penting ing jalur oksidasi asam lemak.
Kaya sing digambarake ing alur kerja sing dituduhake ing Gambar 2a, biomarker kanggo klasifikasi nodul dipikolehi nggunakake operator penyusutan absolut paling cilik lan seleksi adhedhasar 33 metabolit diferensial sing diidentifikasi ing LA (n = 136) lan BN (n = 170). Kombinasi variabel paling apik (LASSO) - model regresi logistik biner. Validasi silang sepuluh kali lipat digunakake kanggo nguji linuwih model. Seleksi variabel lan regularisasi parameter diatur kanthi paukuman maksimalisasi kemungkinan kanthi parameter λ24. Analisis metabolomik global luwih lanjut ditindakake kanthi mandiri ing klompok validasi internal (n = 104) lan validasi eksternal (n = 111) kanggo nguji kinerja klasifikasi model diskriminan. Akibate, 27 metabolit ing set panemuan diidentifikasi minangka model diskriminan paling apik kanthi nilai AUC rata-rata paling gedhe (Gambar 2b), ing antarane 9 duwe aktivitas sing tambah lan 18 aktivitas sing mudhun ing LA dibandhingake karo BN (Gambar 2c).
Alur kerja kanggo mbangun klasifikasi nodul paru, kalebu milih panel metabolit serum paling apik ing set panemuan nggunakake model regresi logistik biner liwat validasi silang sepuluh kali lipat lan ngevaluasi kinerja prediktif ing set validasi internal lan eksternal. b Statistik validasi silang model regresi LASSO kanggo pemilihan biomarker metabolik. Angka-angka sing diwenehake ing ndhuwur makili jumlah rata-rata biomarker sing dipilih ing λ sing diwenehake. Garis putus-putus abang makili nilai AUC rata-rata ing lambda sing cocog. Batang kesalahan abu-abu makili nilai AUC minimum lan maksimum. Garis putus-putus nuduhake model paling apik kanthi 27 biomarker sing dipilih. AUC, area ing sangisore kurva karakteristik operasi panrima (ROC). c Lipat owah-owahan 27 metabolit sing dipilih ing klompok LA dibandhingake karo klompok BN ing klompok panemuan. Kolom abang - aktivasi. Kolom biru minangka penurunan. d – f Kurva karakteristik operasi panrima (ROC) sing nuduhake kekuwatan model diskriminan adhedhasar 27 kombinasi metabolit ing set validasi panemuan, internal, lan eksternal. Data sumber diwenehake ing wangun file data sumber.
Model prediksi digawe adhedhasar koefisien regresi tertimbang saka 27 metabolit iki (Tabel Tambahan 3). Analisis ROC adhedhasar 27 metabolit iki ngasilake nilai area ing sangisore kurva (AUC) 0,933, sensitivitas klompok panemuan yaiku 0,868, lan spesifisitas yaiku 0,859 (Gambar 2d). Sauntara kuwi, ing antarane 38 metabolit diferensial sing diwenehi anotasi antarane LA lan HC, sakumpulan 16 metabolit entuk AUC 0,902 kanthi sensitivitas 0,801 lan spesifisitas 0,856 kanggo mbedakake LA saka HC (Gambar Tambahan 6a-c). Nilai AUC adhedhasar ambang owah-owahan lipatan sing beda kanggo metabolit diferensial uga dibandhingake. Kita nemokake manawa model klasifikasi paling apik kanggo mbedakake antarane LA lan BN (HC) nalika tingkat owah-owahan lipatan disetel dadi 1,2 lawan 1,5 utawa 2,0 (Gambar Tambahan 7a,b). Model klasifikasi, adhedhasar 27 klompok metabolit, divalidasi luwih lanjut ing kohort internal lan eksternal. AUC yaiku 0,915 (sensitivitas 0,867, spesifisitas 0,811) kanggo validasi internal lan 0,945 (sensitivitas 0,810, spesifisitas 0,979) kanggo validasi eksternal (Gambar 2e, f). Kanggo netepake efisiensi antar laboratorium, 40 sampel saka kohort eksternal dianalisis ing laboratorium eksternal kaya sing diterangake ing bagean Metode. Akurasi klasifikasi entuk AUC 0,925 (Gambar Tambahan 8). Amarga karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) minangka subtipe kanker paru-paru non-sel cilik (NSCLC) sing paling umum nomer loro sawise adenokarsinoma paru-paru (LUAD), kita uga nguji potensial utilitas profil metabolik sing divalidasi. BN lan 16 kasus LUSC. AUC diskriminasi antarane LUSC lan BN yaiku 0,776 (Gambar Tambahan 9), sing nuduhake kemampuan sing luwih elek dibandhingake karo diskriminasi antarane LUAD lan BN.
Panliten nuduhake yen ukuran nodul ing gambar CT berkorelasi positif karo kemungkinan keganasan lan tetep dadi penentu utama perawatan nodul25,26,27. Analisis data saka kohort gedhe saka panliten skrining NELSON nuduhake yen risiko keganasan ing subjek kanthi nodul <5 mm malah padha karo subjek tanpa nodul 28. Mulane, ukuran minimal sing mbutuhake pemantauan CT rutin yaiku 5 mm, kaya sing disaranake dening British Thoracic Society (BTS), lan 6 mm, kaya sing disaranake dening Fleischner Society 29. Nanging, nodul sing luwih gedhe saka 6 mm lan tanpa fitur jinak sing jelas, sing diarani nodul paru indeterminate (IPN), tetep dadi tantangan utama ing evaluasi lan manajemen ing praktik klinis30,31. Sabanjure kita nliti apa ukuran nodul mengaruhi tanda tangan metabolomik nggunakake sampel sing dikumpulake saka kohort panemuan lan validasi internal. Fokus ing 27 biomarker sing divalidasi, kita mbandhingake profil PCA saka metabolit HC lan BN sub-6 mm. Kita nemokake manawa umume titik data kanggo HC lan BN tumpang tindih, nuduhake manawa tingkat metabolit serum padha ing kaloro klompok (Gambar 3a). Peta fitur ing macem-macem rentang ukuran tetep dilestarikan ing BN lan LA (Gambar 3b, c), dene pamisahan diamati antarane nodul ganas lan jinak ing kisaran 6-20 mm (Gambar 3d). Kohort iki duwe AUC 0,927, spesifisitas 0,868, lan sensitivitas 0,820 kanggo prédhiksi keganasan nodul sing ukurane 6 nganti 20 mm (Gambar 3e, f). Asil kita nuduhake manawa pengklasifikasi bisa nangkep owah-owahan metabolik sing disebabake dening transformasi ganas awal, preduli saka ukuran nodul.
Perbandingan profil PCA antarane klompok tartamtu adhedhasar klasifikasi metabolik 27 metabolit. CC lan BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. ing LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm lan LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva karakteristik operasi panrima (ROC) sing nuduhake kinerja model diskriminan kanggo nodul 6–20 mm. f Nilai probabilitas diitung adhedhasar model regresi logistik kanggo nodul sing ukurane 6–20 mm. Garis putus-putus abu-abu makili nilai cutoff optimal (0,455). Angka-angka ing ndhuwur makili persentase kasus sing diproyeksikan kanggo Los Angeles. Gunakake uji t Student rong sisi. PCA, analisis komponen utama. Area AUC ing sangisore kurva. Data sumber diwenehake ing wangun file data sumber.
Papat sampel (umur 44-61 taun) kanthi ukuran nodul paru sing padha (7-9 mm) dipilih luwih lanjut kanggo nggambarake kinerja model prediksi keganasan sing diusulake (Gambar 4a, b). Ing skrining awal, Kasus 1 ditampilake minangka nodul padat kanthi kalsifikasi, fitur sing ana gandhengane karo jinak, dene Kasus 2 ditampilake minangka nodul padat sebagian sing ora ditemtokake tanpa fitur jinak sing jelas. Telung puteran pindai CT tindak lanjut nuduhake yen kasus kasebut tetep stabil sajrone periode 4 taun lan mulane dianggep nodul jinak (Gambar 4a). Dibandhingake karo evaluasi klinis pindai CT serial, analisis metabolit serum siji-shot kanthi model pengklasifikasi saiki kanthi cepet lan bener ngenali nodul jinak iki adhedhasar kendala probabilistik (Tabel 1). Gambar 4b ing kasus 3 nuduhake nodul kanthi tandha-tandha retraksi pleura, sing paling asring ana gandhengane karo keganasan32. Kasus 4 ditampilake minangka nodul padat sebagian sing ora ditemtokake tanpa bukti panyebab jinak. Kabeh kasus iki diprediksi minangka ganas miturut model klasifikasi (Tabel 1). Penilaian adenokarsinoma paru-paru dituduhake kanthi pemeriksaan histopatologis sawise operasi reseksi paru-paru (Gambar 4b). Kanggo set validasi eksternal, klasifikasi metabolik kanthi akurat prédhiksi rong kasus nodul paru-paru sing ora ditemtokake luwih gedhe tinimbang 6 mm (Gambar Tambahan 10).
Gambar CT saka jendhela aksial paru-paru saka rong kasus nodul jinak. Ing kasus 1, CT scan sawise 4 taun nuduhake nodul padat sing stabil kanthi ukuran 7 mm kanthi kalsifikasi ing lobus tengen ngisor. Ing kasus 2, CT scan sawise 5 taun nuduhake nodul stabil, sebagian padat kanthi diameter 7 mm ing lobus tengen ndhuwur. b Gambar CT jendhela aksial paru-paru lan studi patologis sing cocog saka rong kasus adenokarsinoma stadium I sadurunge reseksi paru-paru. Kasus 3 nuduhake nodul kanthi diameter 8 mm ing lobus tengen ndhuwur kanthi retraksi pleura. Kasus 4 nuduhake nodul kaca lemah sebagian padat kanthi ukuran 9 mm ing lobus kiwa ndhuwur. Pewarnaan hematoxylin lan eosin (H&E) saka jaringan paru-paru sing direseksi (skala bar = 50 μm) nuduhake pola pertumbuhan asinar adenokarsinoma paru-paru. Panah nuduhake nodul sing dideteksi ing gambar CT. Gambar H&E minangka gambar representatif saka pirang-pirang (>3) lapangan mikroskopis sing ditliti dening ahli patologi.
Yen digabungake, asil panaliten nuduhake potensi nilai biomarker metabolit serum ing diagnosis diferensial nodul paru, sing bisa nuwuhake tantangan nalika ngevaluasi skrining CT.
Adhedhasar panel metabolit diferensial sing wis divalidasi, kita ngupaya ngenali korelasi biologis saka owah-owahan metabolisme utama. Analisis pengayaan jalur KEGG dening MetaboAnalyst ngidentifikasi 6 jalur umum sing owah sacara signifikan antarane rong klompok sing diwenehake (LA vs. HC lan LA vs. BN, p sing disesuaikan ≤ 0,001, efek > 0,01). Owah-owahan kasebut ditondoi dening gangguan ing metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin lan nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, lan metabolisme purin (Gambar 5a). Banjur kita luwih lanjut nindakake metabolomik sing ditargetake kanggo verifikasi owah-owahan utama nggunakake kuantifikasi absolut. Penentuan metabolit umum ing jalur sing umum diowahi kanthi spektrometri massa triple quadrupole (QQQ) nggunakake standar metabolit asli. Karakteristik demografi saka sampel target studi metabolomik kalebu ing Tabel Tambahan 4. Konsisten karo asil metabolomik global, analisis kuantitatif ngonfirmasi manawa hipoksantin lan xanthin, piruvat, lan laktat tambah ing LA dibandhingake karo BN lan HC (Gambar 5b, c, p <0,05). Nanging, ora ana bedane sing signifikan ing metabolit kasebut antarane BN lan HC.
Analisis pengayaan jalur KEGG saka metabolit sing beda banget ing klompok LA dibandhingake karo klompok BN lan HC. Globaltest rong sisi digunakake, lan nilai p diatur nggunakake metode Holm-Bonferroni (p sing diatur ≤ 0,001 lan ukuran efek > 0,01). b–d Plot biola sing nuduhake tingkat hipoksantin, xanthin, laktat, piruvat, lan triptofan ing serum HC, BN, lan LA sing ditemtokake dening LC-MS/MS (n = 70 saben klompok). Garis putus-putus putih lan ireng nuduhake median lan kuartil. e Plot biola sing nuduhake ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip saben yuta) sing normal saka SLC7A5 lan QPRT ing adenokarsinoma paru-paru (n = 513) dibandhingake karo jaringan paru-paru normal (n = 59) ing dataset LUAD-TCGA. Kothak putih nggambarake rentang interkuartil, garis ireng horisontal ing tengah nggambarake median, lan garis ireng vertikal sing metu saka kothak nggambarake interval kapercayan 95% (CI). f Plot korelasi Pearson saka ekspresi SLC7A5 lan GAPDH ing adenokarsinoma paru-paru (n = 513) lan jaringan paru-paru normal (n = 59) ing dataset TCGA. Area abu-abu nggambarake 95% CI. r, koefisien korelasi Pearson. g Tingkat triptofan seluler normal ing sel A549 sing ditransfeksi karo kontrol shRNA nonspesifik (NC) lan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sing ditemtokake dening LC-MS/MS. Analisis statistik saka limang sampel sing independen sacara biologis ing saben klompok ditampilake. h Tingkat seluler NADt (total NAD, kalebu NAD+ lan NADH) ing sel A549 (NC) lan sel A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2). Analisis statistik saka telung sampel sing independen sacara biologis ing saben klompok ditampilake. Aktivitas glikolitik sel A549 sadurunge lan sawise knockdown SLC7A5 diukur nganggo tingkat asidifikasi ekstraseluler (ECAR) (n = 4 sampel sing ora gumantung sacara biologis saben klompok). 2-DG,2-deoksi-D-glukosa. Uji t Student rong sisi digunakake ing (b-h). Ing (g-i), bilah kesalahan makili rata-rata ± SD, saben eksperimen ditindakake kaping telu kanthi independen lan asilé padha. Data sumber diwenehake ing wangun file data sumber.
Ngelingi dampak sing signifikan saka metabolisme triptofan sing owah ing klompok LA, kita uga ngevaluasi tingkat triptofan serum ing klompok HC, BN, lan LA nggunakake QQQ. Kita nemokake yen triptofan serum mudhun ing LA dibandhingake karo HC utawa BN (p <0,001, Gambar 5d), sing konsisten karo temuan sadurunge yen tingkat triptofan sing sirkulasi luwih murah ing pasien kanker paru-paru tinimbang ing kontrol sehat saka klompok kontrol33,34,35. Panaliten liyane sing nggunakake PET/CT tracer 11C-metil-L-triptofan nemokake yen wektu retensi sinyal triptofan ing jaringan kanker paru-paru tambah akeh dibandhingake karo lesi jinak utawa jaringan normal36. Kita duwe hipotesis yen penurunan triptofan ing serum LA bisa uga nuduhake serapan triptofan aktif dening sel kanker paru-paru.
Uga dikenal manawa produk pungkasan saka jalur kynurenin saka katabolisme triptofan yaiku NAD+37,38, sing minangka substrat penting kanggo reaksi gliseraldehida-3-fosfat karo 1,3-bisfosfogliserat ing glikolisis39. Nalika panliten sadurunge wis fokus ing peran katabolisme triptofan ing regulasi kekebalan, kita ngupaya njlentrehake interaksi antarane disregulasi triptofan lan jalur glikolitik sing diamati ing panliten saiki. Anggota kulawarga transporter terlarut 7 5 (SLC7A5) dikenal minangka transporter triptofan43,44,45. Fosforibosiltransferase asam kuinolinat (QPRT) minangka enzim sing dumunung ing sisih hilir jalur kynurenin sing ngowahi asam kuinolinat dadi NAMN46. Inspeksi dataset LUAD TCGA nuduhake manawa SLC7A5 lan QPRT sacara signifikan diregulasi ing jaringan tumor dibandhingake karo jaringan normal (Gambar 5e). Peningkatan iki diamati ing tahap I lan II uga tahap III lan IV adenokarsinoma paru-paru (Gambar Tambahan 11), sing nuduhake gangguan awal ing metabolisme triptofan sing ana gandhengane karo tumorigenesis.
Kajaba iku, dataset LUAD-TCGA nuduhake korelasi positif antarane ekspresi mRNA SLC7A5 lan GAPDH ing sampel pasien kanker (r = 0,45, p = 1,55E-26, Gambar 5f). Kosok baline, ora ana korelasi sing signifikan antarane tandha gen kasebut ing jaringan paru-paru normal (r = 0,25, p = 0,06, Gambar 5f). Knockdown SLC7A5 (Gambar Tambahan 12) ing sel A549 nyuda tingkat triptofan seluler lan NAD(H) kanthi signifikan (Gambar 5g,h), sing nyebabake aktivitas glikolitik sing dilemahake sing diukur kanthi tingkat asidifikasi ekstraseluler (ECAR) (Gambar 1). 5i). Dadi, adhedhasar owah-owahan metabolisme ing serum lan deteksi in vitro, kita duwe hipotesis yen metabolisme triptofan bisa ngasilake NAD+ liwat jalur kynurenine lan nduweni peran penting kanggo ningkatake glikolisis ing kanker paru-paru.
Panliten nuduhake yen akeh nodul paru sing ora ditemtokake sing dideteksi dening LDCT bisa nyebabake kabutuhan tes tambahan kayata PET-CT, biopsi paru-paru, lan perawatan sing berlebihan amarga diagnosis keganasan positif palsu.31 Kaya sing dituduhake ing Gambar 6, panliten kita ngidentifikasi panel metabolit serum kanthi nilai diagnostik potensial sing bisa nambah stratifikasi risiko lan manajemen nodul paru-paru sing dideteksi dening CT.
Nodul paru dievaluasi nggunakake tomografi komputer dosis rendah (LDCT) kanthi fitur pencitraan sing nuduhake panyebab jinak utawa ganas. Asil nodul sing ora mesthi bisa nyebabake kunjungan tindak lanjut sing kerep, intervensi sing ora perlu, lan perawatan sing berlebihan. Kalebu pengklasifikasi metabolik serum kanthi nilai diagnostik bisa ningkatake penilaian risiko lan manajemen nodul paru sabanjure. Tomografi emisi positron PET.
Data saka panliten NLST AS lan panliten NELSON Eropa nuduhake yen skrining klompok risiko dhuwur nganggo tomografi komputer dosis rendah (LDCT) bisa nyuda angka kematian kanker paru-paru1,3. Nanging, penilaian risiko lan manajemen klinis sabanjure saka akeh nodul paru insidental sing dideteksi dening LDCT tetep dadi sing paling tantangan. Tujuan utama yaiku kanggo ngoptimalake klasifikasi sing bener saka protokol adhedhasar LDCT sing ana kanthi nggabungake biomarker sing bisa dipercaya.
Biomarker molekuler tartamtu, kayata metabolit getih, wis diidentifikasi kanthi mbandhingake kanker paru-paru karo kontrol sehat15,17. Ing panliten saiki, kita fokus ing aplikasi analisis metabolomik serum kanggo mbedakake antarane nodul paru jinak lan ganas sing dideteksi kanthi ora sengaja dening LDCT. Kita mbandhingake metabolit serum global kontrol sehat (HC), nodul paru jinak (BN), lan sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) stadium I nggunakake analisis UPLC-HRMS. Kita nemokake manawa HC lan BN duwe profil metabolik sing padha, dene LA nuduhake owah-owahan sing signifikan dibandhingake karo HC lan BN. Kita ngidentifikasi rong set metabolit serum sing mbedakake LA saka HC lan BN.
Skema identifikasi adhedhasar LDCT saiki kanggo nodul jinak lan ganas utamane adhedhasar ukuran, kapadhetan, morfologi, lan tingkat pertumbuhan nodul sajrone wektu30. Panaliten sadurunge nuduhake manawa ukuran nodul ana hubungane karo kemungkinan kanker paru-paru. Sanajan ing pasien risiko dhuwur, risiko keganasan ing nodul <6 mm yaiku <1%. Risiko keganasan kanggo nodul sing ukurane 6 nganti 20 mm antara 8% nganti 64%. Mulane, Fleischner Society nyaranake diameter cutoff 6 mm kanggo tindak lanjut CT rutin.29 Nanging, penilaian risiko lan manajemen nodul paru-paru sing ora ditemtokake (IPN) sing luwih gedhe saka 6 mm durung ditindakake kanthi cukup31. Manajemen penyakit jantung bawaan saiki biasane adhedhasar ngenteni kanthi ati-ati kanthi pemantauan CT sing kerep.
Adhedhasar metabolit sing wis divalidasi, kita nduduhake kanggo pisanan tumpang tindih tandha metabolomik antarane individu sing sehat lan nodul jinak <6 mm. Kemiripan biologis iki konsisten karo temuan CT sadurunge yen risiko keganasan kanggo nodul <6 mm padha karo subjek tanpa nodul.30 Perlu dicathet yen asil kita uga nduduhake yen nodul jinak <6 mm lan ≥6 mm duwe kemiripan sing dhuwur ing profil metabolomik, sing nuduhake yen definisi fungsional etiologi jinak konsisten tanpa preduli saka ukuran nodul. Mangkono, panel metabolit serum diagnostik modern bisa nyedhiyakake uji coba tunggal minangka tes aturan metu nalika nodul wiwitane dideteksi ing CT lan duweni potensi nyuda pemantauan serial. Ing wektu sing padha, panel biomarker metabolik sing padha mbedakake nodul ganas ukuran ≥6 mm saka nodul jinak lan nyedhiyakake prediksi sing akurat kanggo IPN kanthi ukuran sing padha lan fitur morfologis sing ambigu ing gambar CT. Klasifikasi metabolisme serum iki nindakake kanthi apik kanggo prédhiksi keganasan nodul ≥6 mm kanthi AUC 0,927. Dijupuk bebarengan, asil kita nuduhake yen tandha metabolisme serum sing unik bisa uga nggambarake owah-owahan metabolisme awal sing disebabake tumor lan duwe nilai potensial minangka prediktor risiko, ora preduli saka ukuran nodul.
Khususé, adenokarsinoma paru-paru (LUAD) lan karsinoma sel skuamosa (LUSC) minangka jinis utama kanker paru-paru non-sel cilik (NSCLC). Amarga LUSC ana gandheng cenenge karo panggunaan rokok47 lan LUAD minangka histologi nodul paru-paru insidental sing paling umum sing dideteksi ing skrining CT48, model klasifikasi kita digawe khusus kanggo sampel adenokarsinoma stadium I. Wang lan kolega uga fokus ing LUAD lan ngidentifikasi sangang tandha lipid nggunakake lipidomik kanggo mbedakake kanker paru-paru stadium awal saka individu sing sehat17. Kita nguji model klasifikasi saiki ing 16 kasus LUSC stadium I lan 74 nodul jinak lan mirsani akurasi prediksi LUSC sing kurang (AUC 0,776), sing nuduhake yen LUAD lan LUSC bisa uga duwe tandha metabolomik dhewe. Pancen, LUAD lan LUSC wis dituduhake beda ing etiologi, asal biologis lan penyimpangan genetik49. Mulane, jinis histologi liyane kudu dilebokake ing model pelatihan kanggo deteksi kanker paru-paru adhedhasar populasi ing program skrining.
Ing kene, kita ngidentifikasi enem jalur sing paling kerep owah ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol sehat lan nodul jinak. Xanthine lan hipoksantin minangka metabolit umum saka jalur metabolisme purin. Konsisten karo asil kita, zat antara sing ana gandhengane karo metabolisme purin tambah akeh ing serum utawa jaringan pasien adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol sehat utawa pasien ing tahap preinvasif15,50. Tingkat xanthine lan hipoksantin serum sing dhuwur bisa uga nggambarake anabolisme sing dibutuhake dening sel kanker sing cepet berkembang biak. Disregulasi metabolisme glukosa minangka ciri khas metabolisme kanker51. Ing kene, kita mirsani peningkatan piruvat lan laktat sing signifikan ing klompok LA dibandhingake karo klompok HC lan BN, sing konsisten karo laporan sadurunge babagan kelainan jalur glikolitik ing profil metabolit serum pasien kanker paru-paru non-sel cilik (NSCLC) lan kontrol sehat. asil kasebut konsisten52,53.
Sing penting, kita mirsani korelasi kebalikan antarane metabolisme piruvat lan triptofan ing serum adenokarsinoma paru-paru. Kadar triptofan serum mudhun ing klompok LA dibandhingake karo klompok HC utawa BN. Menariknya, panliten skala gedhe sadurunge nggunakake kohort prospektif nemokake manawa tingkat triptofan sing sirkulasi sithik ana gandhengane karo peningkatan risiko kanker paru-paru 54. Triptofan minangka asam amino esensial sing kita entuk saka panganan. Kita nyimpulake manawa penipisan triptofan serum ing adenokarsinoma paru-paru bisa uga nggambarake penipisan metabolit iki kanthi cepet. Wis dingerteni manawa produk pungkasan saka katabolisme triptofan liwat jalur kynurenine minangka sumber sintesis NAD+ de novo. Amarga NAD+ diprodhuksi utamane liwat jalur salvage, pentinge NAD+ ing metabolisme triptofan ing kesehatan lan penyakit isih kudu ditemtokake 46. Analisis kita babagan basis data TCGA nuduhake yen ekspresi transporter triptofan transporter zat terlarut 7A5 (SLC7A5) tambah akeh ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol normal lan berkorelasi positif karo ekspresi enzim glikolitik GAPDH. Panaliten sadurunge utamane fokus ing peran katabolisme triptofan ing nyuda respon imun antitumor40,41,42. Ing kene kita nduduhake yen inhibisi penyerapan triptofan kanthi knockdown SLC7A5 ing sel kanker paru-paru nyebabake penurunan tingkat NAD seluler lan atenuasi aktivitas glikolitik. Ringkesane, panliten kita nyedhiyakake basis biologis kanggo owah-owahan metabolisme serum sing ana gandhengane karo transformasi ganas adenokarsinoma paru-paru.
Mutasi EGFR minangka mutasi pendorong sing paling umum ing pasien NSCLC. Ing panliten kita, kita nemokake manawa pasien kanthi mutasi EGFR (n = 41) duwe profil metabolisme sakabèhé padha karo pasien kanthi EGFR tipe liar (n = 31), sanajan kita nemokake tingkat serum sing mudhun saka sawetara pasien mutan EGFR ing pasien asilkarnitin. Fungsi asilkarnitin sing wis ditetepake yaiku ngeterake gugus asil saka sitoplasma menyang matriks mitokondria, sing nyebabake oksidasi asam lemak kanggo ngasilake energi 55. Konsisten karo temuan kita, panliten anyar uga ngidentifikasi profil metabolit sing padha antarane tumor mutan EGFR lan tipe liar EGFR kanthi nganalisa metabolit global saka 102 sampel jaringan adenokarsinoma paru-paru 50. Menariknya, kandungan asilkarnitin uga ditemokake ing klompok mutan EGFR. Mulane, apa owah-owahan ing tingkat asilkarnitin nggambarake owah-owahan metabolisme sing diinduksi EGFR lan jalur molekuler sing ndasari bisa uga dibutuhake panliten luwih lanjut.
Kesimpulane, panliten kita netepake klasifikasi metabolik serum kanggo diagnosis diferensial nodul paru lan ngusulake alur kerja sing bisa ngoptimalake penilaian risiko lan nggampangake manajemen klinis adhedhasar skrining CT scan.
Panliten iki disetujoni dening Komite Etik Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, lan Komite Etik Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou. Ing klompok panemuan lan validasi internal, 174 sera saka individu sing sehat lan 244 sera saka nodul jinak dikumpulake saka individu sing nglakoni pemeriksaan medis taunan ing Departemen Pengendalian lan Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, lan 166 nodul jinak. serum. Adenokarsinoma paru stadium I dikumpulake saka Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Ing kohort validasi eksternal, ana 48 kasus nodul jinak, 39 kasus adenokarsinoma paru stadium I saka Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, lan 24 kasus adenokarsinoma paru stadium I saka Rumah Sakit Kanker Zhengzhou. Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen uga nglumpukake 16 kasus kanker paru-paru sel skuamosa stadium I kanggo nguji kemampuan diagnostik saka klasifikasi metabolik sing wis ditetepake (karakteristik pasien dituduhake ing Tabel Tambahan 5). Sampel saka kohort panemuan lan kohort validasi internal dikumpulake antarane Januari 2018 lan Mei 2020. Sampel kanggo kohort validasi eksternal dikumpulake antarane Agustus 2021 lan Oktober 2022. Kanggo nyuda bias gender, jumlah kasus lanang lan wadon sing meh padha ditugasake kanggo saben kohort. Tim Panemuan lan Tim Peninjau Internal. Jenis kelamin peserta ditemtokake adhedhasar laporan mandiri. Persetujuan sing diinformasikake dipikolehi saka kabeh peserta lan ora ana kompensasi sing diwenehake. Subjek kanthi nodul jinak yaiku sing duwe skor CT scan stabil ing 2 nganti 5 taun nalika analisis, kajaba 1 kasus saka sampel validasi eksternal, sing dikumpulake sadurunge operasi lan didiagnosis kanthi histopatologi. Kajaba bronkitis kronis. Kasus adenokarsinoma paru-paru dikumpulake sadurunge reseksi paru-paru lan dikonfirmasi kanthi diagnosis patologis. Sampel getih pasa dikumpulake ing tabung pamisahan serum tanpa antikoagulan. Sampel getih digumpalake sajrone 1 jam ing suhu kamar banjur disentrifugasi ing 2851 × g sajrone 10 menit ing suhu 4°C kanggo ngumpulake supernatan serum. Alikuot serum dibekukan ing suhu -80°C nganti ekstraksi metabolit. Departemen Pencegahan Kanker lan Pemeriksaan Medis Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen ngumpulake serum saka 100 donor sehat, kalebu pria lan wanita sing umure 40 nganti 55 taun kanthi jumlah sing padha. Volume saben sampel donor dicampur, asilé dialikuot lan disimpen ing suhu -80°C. Campuran serum digunakake minangka bahan referensi kanggo kontrol kualitas lan standarisasi data.
Serum referensi lan sampel tes dicairke lan metabolit diekstrak nggunakake metode ekstraksi gabungan (MTBE/metanol/banyu) 56. Secara ringkes, 50 μl serum dicampur karo 225 μl metanol adhem lan 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) adhem. Aduk campuran kasebut lan inkubasi ing es sajrone 1 jam. Sampel banjur dicampur lan divorteks dicampur karo 188 μl banyu kelas MS sing ngemot standar internal (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin, lan 13C6-isoleusin, sing dituku saka Cambridge Isotope Laboratories). Campuran kasebut banjur disentrifugasi ing 15.000 × g sajrone 10 menit ing suhu 4 °C, lan fase ngisor ditransfer menyang rong tabung (saben 125 μL) kanggo analisis LC-MS ing mode positif lan negatif. Pungkasan, sampel diuapke nganti garing ing konsentrator vakum kecepatan tinggi.
Metabolit sing wis garing dibentuk maneh ing 120 μl asetonitril 80%, divorteks sajrone 5 menit, lan disentrifugasi ing 15.000 × g sajrone 10 menit ing suhu 4°C. Supernatan ditransfer menyang botol kaca kuning nganggo microinsert kanggo studi metabolomik. Analisis metabolomik tanpa target ing platform spektrometri massa resolusi tinggi kromatografi cair kinerja ultra (UPLC-HRMS). Metabolit dipisahake nggunakake sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC lan kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Ing mode ion positif, fase gerak yaiku 95% (A) lan 50% asetonitril (B), saben ngemot 10 mmol/L amonium asetat lan 0,1% asam format. Ing mode negatif, fase gerak A lan B ngandhut 95% lan 50% asetonitril, kaloro fase kasebut ngandhut 10 mmol/L amonium asetat, pH = 9. Program gradien kaya ing ngisor iki: 0–0,5 menit, 2% B; 0,5–12 menit, 2–50% B; 12–14 menit, 50–98% B; 14–16 menit, 98% B; 16–16,1 menit, 98–2% B; 16,1–20 menit, 2% B. Kolom dijaga ing suhu 40°C lan sampel ing suhu 10°C ing autosampler. Laju aliran yaiku 0,3 ml/menit, volume injeksi yaiku 3 μl. Spektrometer massa Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) nganggo sumber ionisasi electrospray (ESI) dioperasikake ing mode pindai lengkap lan digandhengake karo mode pemantauan ddMS2 kanggo ngumpulake data kanthi volume gedhe. Parameter MS disetel kaya ing ngisor iki: voltase semprotan +3,8 kV/- 3,2 kV, suhu kapiler 320°C, gas pelindung 40 arb, gas bantu 10 arb, suhu pemanas probe 350°C, rentang pindai 70–1050 m/jam, resolusi. 70 000. Data dipikolehi nggunakake Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Kanggo netepake kualitas data, sampel kontrol kualitas (QC) sing dikumpulake digawe kanthi mbusak 10 μL alikuot supernatant saka saben sampel. Enem injeksi sampel kontrol kualitas dianalisis ing awal urutan analitis kanggo netepake stabilitas sistem UPLC-MS. Sampel kontrol kualitas banjur dilebokake kanthi periodik menyang batch. Kabeh 11 batch sampel serum ing panliten iki dianalisis nganggo LC-MS. Alikuot campuran blumbang serum saka 100 donor sehat digunakake minangka bahan referensi ing batch masing-masing kanggo ngawasi proses ekstraksi lan nyetel efek batch-to-batch. Analisis metabolomik sing ora ditargetake saka kohort panemuan, kohort validasi internal, lan kohort validasi eksternal ditindakake ing Pusat Metabolomik Universitas Sun Yat-sen. Laboratorium eksternal Pusat Analisis lan Pengujian Teknologi Universitas Guangdong uga nganalisa 40 sampel saka kohort eksternal kanggo nguji kinerja model klasifikasi.
Sawisé ekstraksi lan rekonstitusi, kuantifikasi absolut metabolit serum diukur nganggo kromatografi cair kinerja ultra-tinggi-spektrometri massa tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) nganggo sumber ionisasi elektrospray (ESI) ing mode pemantauan reaksi ganda (MRM). Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) digunakake kanggo misahake metabolit. Fase gerak kasusun saka 90% (A) lan 5% asetonitril (B) kanthi 10 mmol/L amonium asetat lan larutan amonia 0,1%. Program gradien kaya ing ngisor iki: 0–1,5 menit, 0% B; 1,5–6,5 menit, 0–15% B; 6,5–8 menit, 15% B; 8–8,5 menit, 15%–0% B; 8,5–11,5 menit, 0%B. Kolom dijaga ing suhu 40 °C lan sampel ing suhu 10 °C ing autosampler. Laju aliran yaiku 0,3 mL/menit lan volume injeksi yaiku 1 μL. Parameter MS disetel kaya ing ngisor iki: voltase kapiler ±3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas selubung 12 L/menit, suhu gas selubung 350°C, suhu gas pangatusan 250°C, lan aliran gas pangatusan 14 l/menit. Konversi MRM saka triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin lan xanthin yaiku 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 lan 151,0–107,9. Data dikumpulake nggunakake Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Kanggo sampel serum, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin, lan xanthin diukur nggunakake kurva kalibrasi larutan campuran standar. Kanggo sampel sel, kandungan triptofan dinormalisasi menyang standar internal lan massa protein sel.
Ekstraksi puncak (m/z lan wektu retensi (RT)) ditindakake nggunakake Compound Discovery 3.1 lan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Kanggo ngilangi beda potensial antarane batch, saben puncak karakteristik sampel tes dibagi karo puncak karakteristik materi referensi saka batch sing padha kanggo entuk kelimpahan relatif. Deviasi standar relatif saka standar internal sadurunge lan sawise standarisasi dituduhake ing Tabel Tambahan 6. Bedane antarane rong klompok kasebut ditondoi kanthi tingkat panemuan palsu (FDR<0,05, uji peringkat Wilcoxon signed) lan owah-owahan lipatan (>1,2 utawa <0,83). Data MS mentah saka fitur sing diekstrak lan data MS sing dikoreksi serum referensi dituduhake ing Data Tambahan 1 lan Data Tambahan 2. Anotasi puncak ditindakake adhedhasar papat tingkat identifikasi sing ditetepake, kalebu metabolit sing diidentifikasi, senyawa sing dianotasi kanthi dugaan, kelas senyawa sing diidentifikasi kanthi dugaan, lan senyawa sing ora dingerteni 22. Adhedhasar panelusuran basis data ing Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), senyawa biologis kanthi standar sing cocog karo MS/MS sing divalidasi utawa anotasi cocog sing pas ing mzCloud (skor > 85) utawa Chemspider pungkasane dipilih minangka perantara antarane metabolit diferensial. Anotasi puncak kanggo saben fitur kalebu ing Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 digunakake kanggo analisis univariat saka kelimpahan metabolit sing dinormalisasi jumlah. MetaboAnalyst 5.0 uga ngevaluasi analisis pengayaan jalur KEGG adhedhasar metabolit sing beda banget. Analisis komponen utama (PCA) lan analisis diskriminan kuadrat paling cilik parsial (PLS-DA) dianalisis nggunakake paket piranti lunak ropls (v.1.26.4) kanthi normalisasi tumpukan lan penskalaan otomatis. Model biomarker metabolit optimal kanggo prédhiksi keganasan nodul digawe nggunakake regresi logistik biner kanthi operator penyusutan lan seleksi paling ora absolut (LASSO, paket R v.4.1-3). Kinerja model diskriminan ing set deteksi lan validasi ditondoi kanthi ngira-ngira AUC adhedhasar analisis ROC miturut paket pROC (v.1.18.0.). Batas probabilitas optimal dipikolehi adhedhasar indeks Youden maksimum model (sensitivitas + spesifisitas - 1). Sampel kanthi nilai kurang utawa luwih gedhe tinimbang ambang batas bakal diprediksi minangka nodul jinak lan adenokarsinoma paru-paru.
Sel A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ditumbuhake ing medium F-12K sing ngandhut 10% FBS. Urutan RNA hairpin cendhak (shRNA) sing nargetake SLC7A5 lan kontrol nontargeting (NC) dilebokake menyang vektor lentiviral pLKO.1-puro. Urutan antisense shSLC7A5 kaya ing ngisor iki: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antibodi kanggo SLC7A5 (#5347) lan tubulin (#2148) dituku saka Cell Signaling Technology. Antibodi kanggo SLC7A5 lan tubulin digunakake kanthi pengenceran 1:1000 kanggo analisis Western blot.
Tes Stres Glikolitik Seahorse XF ngukur tingkat asidifikasi ekstraseluler (ECAR). Ing uji coba kasebut, glukosa, oligomisin A, lan 2-DG diwenehake kanthi runtut kanggo nguji kapasitas glikolitik seluler sing diukur dening ECAR.
Sel A549 sing ditransfeksi nganggo kontrol non-targeting (NC) lan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) dilebokake sewengi ing piring diameter 10 cm. Metabolit sel diekstrak nganggo 1 ml metanol banyu 80% sing adhem. Sel ing larutan metanol dikerok, dikumpulake menyang tabung anyar, lan disentrifugasi ing 15.000 × g sajrone 15 menit ing suhu 4°C. Kumpulake 800 µl supernatant lan garingake nganggo konsentrator vakum kecepatan tinggi. Pelet metabolit sing wis garing banjur dianalisis kanggo tingkat triptofan nggunakake LC-MS/MS kaya sing diterangake ing ndhuwur. Tingkat NAD(H) seluler ing sel A549 (NC lan shSLC7A5) diukur nggunakake kit kolorimetri NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) miturut pandhuan pabrikan. Tingkat protein diukur kanggo saben sampel kanggo normalake jumlah metabolit.
Ora ana metode statistik sing digunakake kanggo nemtokake ukuran sampel sadurunge. Panliten metabolomik sadurunge sing ditujokake kanggo panemuan biomarker15,18 wis dianggep minangka patokan kanggo nemtokake ukuran, lan dibandhingake karo laporan kasebut, sampel kita cukup. Ora ana sampel sing diilangi saka kohort panliten. Sampel serum ditugasake kanthi acak menyang klompok panemuan (306 kasus, 74,6%) lan klompok validasi internal (104 kasus, 25,4%) kanggo panliten metabolomik sing ora ditargetake. Kita uga milih kanthi acak 70 kasus saka saben klompok saka set panemuan kanggo panliten metabolomik sing ditargetake. Para peneliti ora weruh babagan penetapan klompok sajrone pangumpulan lan analisis data LC-MS. Analisis statistik data metabolomik lan eksperimen sel diterangake ing bagean Asil, Legenda Gambar, lan Metode masing-masing. Kuantifikasi triptofan seluler, NADT, lan aktivitas glikolitik ditindakake kaping telu kanthi independen kanthi asil sing padha.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain panliten, deleng Abstrak Laporan Portofolio Alami sing ana gandhengane karo artikel iki.
Data MS mentah saka fitur sing diekstrak lan data MS sing dinormalisasi saka serum referensi dituduhake ing Data Tambahan 1 lan Data Tambahan 2. Anotasi puncak kanggo fitur diferensial dituduhake ing Data Tambahan 3. Set data LUAD TCGA bisa diunduh saka https://portal.gdc.cancer.gov/. Data input kanggo nggambar grafik diwenehake ing data sumber. Data sumber diwenehake kanggo artikel iki.
Kelompok Studi Skrining Paru-paru Nasional, lan liya-liyane. Ngurangi angka kematian kanker paru-paru nganggo tomografi komputer dosis rendah. Inggris Lor. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR lan Prophet, PC Skrining kanker paru-paru nggunakake CT heliks dosis rendah: asil saka National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Ngurangi angka kematian kanker paru-paru nganggo skrining CT volumetrik ing uji coba acak. Inggris Lor. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Wektu kiriman: 18-Sep-2023