Diagnosis diferensial saka nodul paru sing diidentifikasi kanthi tomografi komputer (CT) tetep dadi tantangan ing praktik klinis.Ing kene, kita nemtokake metabolom global saka 480 conto serum, kalebu kontrol sehat, nodul paru-paru jinak, lan adenokarsinoma paru-paru tahap I.Adenokarsinoma nuduhake profil metabolomik sing unik, dene nodul jinak lan individu sing sehat duwe persamaan sing dhuwur ing profil metabolomik.Ing klompok panemuan (n = 306), sakumpulan 27 metabolit diidentifikasi kanggo mbedakake antarane nodul sing entheng lan ganas.AUC saka model diskriminan ing validasi internal (n = 104) lan validasi eksternal (n = 111) kelompok yaiku 0.915 lan 0.945.Analisis pathway ngungkapake metabolit glikolitik sing ana gandhengane karo penurunan triptofan ing serum adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo nodul jinak lan kontrol sing sehat, lan nyaranake yen penyerapan triptofan ningkatake glikolisis ing sel kanker paru-paru.Panaliten kita nyoroti nilai biomarker metabolit serum ing pambiji risiko nodul paru sing dideteksi dening CT.
Diagnosis awal penting kanggo ningkatake tingkat kaslametan kanggo pasien kanker.Asil saka US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) lan European NELSON Study wis nuduhake yen screening karo low-dosis computed tomography (LDCT) bisa nyuda mortalitas kanker paru-paru kanthi signifikan ing grup berisiko tinggi1,2,3.Wiwit nyebarake LDCT kanggo skrining kanker paru-paru, kedadeyan temuan radiografi insidental saka nodul paru asimtomatik terus meningkat 4.Nodul pulmonal ditetepake minangka opacity fokus nganti diameter 3 cm 5.Kita ngadhepi kangelan ing netepke kamungkinan saka malignancy lan dealing with nomer akeh pulmonary nodules dideteksi satleraman ing LDCT.Watesan CT bisa nyebabake pemeriksaan tindak lanjut sing kerep lan asil positif palsu, nyebabake intervensi sing ora perlu lan overtreatment6.Mulane, perlu kanggo ngembangake biomarker sing dipercaya lan migunani kanggo ngenali kanker paru-paru kanthi bener ing tahap awal lan mbedakake nodul sing paling jinak ing deteksi awal 7.
Analisis molekuler getih sing komprehensif (serum, plasma, sel mononuklear getih perifer), kalebu genomik, proteomik utawa metilasi DNA8,9,10, wis mimpin kanggo nambah kapentingan ing panemuan biomarker diagnostik kanggo kanker paru-paru.Sauntara kuwi, pendekatan metabolomik ngukur produk pungkasan seluler sing dipengaruhi dening tumindak endogen lan eksogen lan mulane ditrapake kanggo prédhiksi onset lan asil penyakit.Cairan chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) minangka cara sing akeh digunakake kanggo studi metabolomik amarga sensitivitas dhuwur lan rentang dinamis sing gedhe, sing bisa nutupi metabolit kanthi sifat fisikokimia sing beda11,12,13.Sanajan analisis metabolomik global plasma / serum wis digunakake kanggo ngenali biomarker sing ana gandhengane karo diagnosis kanker paru-paru14,15,16,17 lan khasiat perawatan, klasifikasi metabolit 18 serum kanggo mbedakake antarane nodul paru-paru jinak lan ganas tetep akeh diteliti.- riset massive.
Adenokarsinoma lan karsinoma sel skuamosa minangka rong subtipe utama kanker paru-paru sel non-cilik (NSCLC).Macem-macem tes skrining CT nuduhake yen adenokarsinoma minangka jinis histologis kanker paru-paru sing paling umum1,19,20,21.Ing panliten iki, kita nggunakake ultra-kinerja cairan kromatografi-dhuwur-resolusi spektrometri massa (UPLC-HRMS) kanggo nindakake analisis metabolomik ing total 695 conto serum, kalebu kontrol sehat, nodul pulmonary jinak, lan CT-dideteksi ≤3 cm.Skrining adenokarsinoma paru Tahap I.Kita nemtokake panel metabolit serum sing mbedakake adenokarsinoma paru-paru saka nodul entheng lan kontrol sehat.Analisis pengayaan jalur nuduhake yen metabolisme triptofan lan glukosa sing ora normal minangka owah-owahan umum ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo nodul entheng lan kontrol sing sehat.Pungkasan, kita nggawe lan validasi klasifikasi metabolik serum kanthi spesifik lan sensitivitas sing dhuwur kanggo mbedakake antara nodul paru-paru ganas lan entheng sing dideteksi dening LDCT, sing bisa mbantu diagnosis diferensial awal lan penilaian risiko.
Ing panliten saiki, sampel serum sing cocog karo jinis lan umur diklumpukake sacara retrospektif saka 174 kontrol sehat, 292 pasien karo nodul paru-paru jinak, lan 229 pasien karo adenokarsinoma paru-paru tahap I.Karakteristik demografi saka 695 subjek ditampilake ing Tabel Tambahan 1.
Kaya sing dituduhake ing Gambar 1a, total 480 conto serum, kalebu 174 kontrol sehat (HC), 170 nodul jinak (BN), lan 136 sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) tahap I, diklumpukake ing Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen.Kohort panemuan kanggo profil metabolomik sing ora ditargetake nggunakake spektrometri massa kromatografi cair ultra-kinerja-dhuwur (UPLC-HRMS).Kaya sing ditampilake ing Gambar Tambahan 1, metabolit diferensial antarane LA lan HC, LA lan BN diidentifikasi kanggo nggawe model klasifikasi lan luwih njelajah analisis jalur diferensial.Sampel 104 sing diklumpukake dening Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen lan 111 conto sing diklumpukake dening rong rumah sakit liyane ditindakake validasi internal lan eksternal.
Populasi sinau ing kohort panemuan sing ngalami analisis metabolomik serum global nggunakake spektrometri massa kromatografi cair ultra-kinerja-resolusi dhuwur (UPLC-HRMS).b Analisis diskriminan kuadrat paling sithik (PLS-DA) saka total metabolom saka 480 sampel serum saka kohort sinau, kalebu kontrol sehat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), lan adenokarsinoma paru-paru tahap I (Los Angeles, n = 136).+ESI, mode ionisasi electrospray positif, -ESI, mode ionisasi electrospray negatif.c-e Metabolit kanthi kelimpahan sing beda banget ing rong klompok tartamtu (uji peringkat Wilcoxon loro-buntut, nilai p sing disetel tingkat panemuan palsu, FDR <0,05) ditampilake kanthi warna abang (owahan lipatan> 1,2) lan biru (ganti lipatan <0,83) .) ditampilake ing grafik gunung geni.f Peta panas clustering hirarkis nuduhake beda pinunjul ing nomer metabolit annotated antarane LA lan BN.Data sumber diwenehake kanthi wujud file data sumber.
Total metabolom serum saka 174 HC, 170 BN lan 136 LA ing klompok panemuan dianalisis nggunakake analisis UPLC-HRMS.Kita pisanan nuduhake yen kontrol kualitas (QC) conto cluster tightly ing tengah model unsupervised principal component analysis (PCA), konfirmasi stabilitas kinerja sinau saiki (Tambahan Gambar 2).
Kaya sing ditampilake ing analisis diskriminasi kuadrat paling sithik (PLS-DA) ing Gambar 1 b, kita nemokake manawa ana bedane sing jelas antarane LA lan BN, LA lan HC ing mode ionisasi electrospray positif (+ESI) lan negatif (-ESI). .diisolasi.Nanging, ora ana beda sing signifikan ing antarane BN lan HC ing + ESI lan -ESI kahanan.
Kita nemokake 382 fitur diferensial antarane LA lan HC, 231 fitur diferensial antarane LA lan BN, lan 95 fitur diferensial antarane BN lan HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 lan sawetara owah-owahan> 1,2 utawa <0,83) (Gambar .1c-e )..Puncak luwih dianotasi (Data Tambahan 3) marang database (perpustakaan mzCloud / HMDB / Chemspider) kanthi nilai m / z, wektu retensi lan telusuran spektrum massa fragmentasi (rincian sing diterangake ing bagean Metode) 22.Pungkasan, metabolit anotasi 33 lan 38 kanthi macem-macem kelimpahan diidentifikasi kanggo LA versus BN (Gambar 1f lan Tabel Tambahan 2) lan LA versus HC (Gambar Tambahan 3 lan Tabel Tambahan 2).Ing kontras, mung 3 metabolit sing beda-beda akeh sing diidentifikasi ing BN lan HC (Tabel Tambahan 2), konsisten karo tumpang tindih antarane BN lan HC ing PLS-DA.Metabolit diferensial iki nyakup macem-macem biokimia (Tambahan Gambar 4).Digabungake, asil kasebut nuduhake owah-owahan sing signifikan ing metabolisme serum sing nggambarake transformasi ganas kanker paru-paru tahap awal dibandhingake karo nodul paru-paru jinak utawa subyek sing sehat.Kangge, persamaan metabolom serum BN lan HC nuduhake yen nodul paru-paru jinak bisa nuduhake akeh ciri biologis karo individu sing sehat.Amarga mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) umum ing subtipe adenokarsinoma paru-paru 23, kita ngupaya kanggo nemtokake dampak mutasi driver ing metabolisme serum.Kita banjur nganalisa profil metabolomik sakabèhé saka 72 kasus kanthi status EGFR ing klompok adenokarsinoma paru-paru.Sing nggumunake, kita nemokake profil sing bisa dibandhingake antarane pasien mutan EGFR (n = 41) lan pasien jinis liar EGFR (n = 31) ing analisis PCA (Tambahan Gambar 5a).Nanging, kita nemtokake 7 metabolit sing akeh banget diowahi ing pasien kanthi mutasi EGFR dibandhingake karo pasien kanthi EGFR tipe liar (tes t, p <0.05 lan owah-owahan lipatan> 1.2 utawa <0.83) (Tambahan Gambar 5b).Mayoritas metabolit kasebut (5 saka 7) yaiku acylcarnitines, sing nduweni peran penting ing jalur oksidasi asam lemak.
Kaya sing digambarake ing alur kerja sing ditampilake ing Figure 2 a, biomarker kanggo klasifikasi nodul dipikolehi kanthi nggunakake operator penyusutan absolut lan pilihan sing adhedhasar 33 metabolit diferensial sing diidentifikasi ing LA (n = 136) lan BN (n = 170).Kombinasi variabel paling apik (LASSO) - model regresi logistik binar.Validasi silang kaping sepuluh digunakake kanggo nguji reliabilitas model kasebut.Pilihan variabel lan regularisasi parameter diatur kanthi paukuman maksimalisasi kemungkinan kanthi parameter λ24.Analisis metabolomik global luwih ditindakake kanthi mandiri ing validasi internal (n = 104) lan validasi eksternal (n = 111) kelompok kanggo nguji kinerja klasifikasi model diskriminan.Akibaté, metabolit 27 ing set panemuan diidentifikasi minangka model diskriminan paling apik kanthi nilai AUC rata-rata paling gedhé (Gambar 2b), ing antarané 9 wis nambah aktivitas lan 18 ngurangi aktivitas ing LA dibandhingake karo BN (Gambar 2c).
Alur kerja kanggo mbangun klasifikasi nodul paru, kalebu milih panel metabolit serum sing paling apik ing set panemuan nggunakake model regresi logistik binar liwat validasi silang sepuluh kali lan ngevaluasi kinerja prediksi ing set validasi internal lan eksternal.b Statistik validasi silang saka model regresi LASSO kanggo pilihan biomarker metabolik.Angka-angka ing ndhuwur nggambarake jumlah rata-rata biomarker sing dipilih ing λ tartamtu.Garis titik abang nuduhake nilai AUC rata-rata ing lambda sing cocog.Bar kesalahan abu-abu nggambarake nilai AUC minimal lan maksimal.Garis burik nuduhake model paling apik kanthi 27 biomarker sing dipilih.AUC, area ing kurva karakteristik operasi panrima (ROC).c Lipat owah-owahan saka 27 metabolit sing dipilih ing klompok LA dibandhingake karo klompok BN ing klompok panemuan.Kolom abang - aktivasi.Kolom biru mudhun.Kurva karakteristik operasi panrima (ROC) d–f nuduhake kekuwatan model diskriminan adhedhasar kombinasi metabolit 27 ing set validasi panemuan, internal lan eksternal.Data sumber diwenehake kanthi wujud file data sumber.
Model prediksi digawe adhedhasar koefisien regresi bobot saka 27 metabolit kasebut (Tabel Tambahan 3).Analisis ROC adhedhasar 27 metabolit kasebut ngasilake area ing sangisore kurva (AUC) 0,933, sensitivitas klompok panemuan yaiku 0,868, lan spesifik yaiku 0,859 (Gambar 2d).Kangge, ing antarane 38 metabolit diferensial anotasi antarane LA lan HC, sakumpulan metabolit 16 entuk AUC 0.902 kanthi sensitivitas 0.801 lan spesifisitas 0.856 kanggo mbedakake LA saka HC (Tambahan Gambar 6a-c).Nilai AUC adhedhasar ambang owah-owahan lipatan beda kanggo metabolit diferensial uga dibandhingake.Kita nemokake manawa model klasifikasi nindakake paling apik kanggo mbedakake antarane LA lan BN (HC) nalika tingkat pangowahan lipatan disetel dadi 1.2 versus 1.5 utawa 2.0 (Tambahan Gambar 7a, b).Model klasifikasi, adhedhasar 27 klompok metabolit, luwih divalidasi ing kohort internal lan eksternal.AUC yaiku 0,915 (sensitivitas 0,867, spesifisitas 0,811) kanggo validasi internal lan 0,945 (sensitivitas 0,810, spesifisitas 0,979) kanggo validasi eksternal (Gambar 2e, f).Kanggo netepake efisiensi interlaboratorium, 40 conto saka kohort eksternal dianalisis ing laboratorium eksternal kaya sing diterangake ing bagean Metode.Akurasi klasifikasi entuk AUC 0.925 (Tambahan Gambar 8).Amarga karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) minangka subtipe paling umum nomer loro saka kanker paru-paru non-small cell (NSCLC) sawise adenokarsinoma paru-paru (LUAD), kita uga nguji utilitas potensial profil metabolik sing wis divalidasi.BN lan 16 kasus LUSC.AUC diskriminasi antarane LUSC lan BN yaiku 0.776 (Tambahan Gambar 9), nuduhake kemampuan sing luwih miskin dibandhingake karo diskriminasi antarane LUAD lan BN.
Panaliten nuduhake yen ukuran nodul ing gambar CT duwe hubungan positif karo kemungkinan ganas lan tetep dadi penentu utama perawatan nodul25,26,27.Analisis data saka kohort gedhe saka studi screening NELSON nuduhake yen risiko ganas ing subyek kanthi kelenjar <5 mm malah padha karo subyek tanpa kelenjar 28.Mulane, ukuran minimal sing mbutuhake pemantauan CT biasa yaiku 5 mm, kaya sing disaranake dening British Thoracic Society (BTS), lan 6 mm, kaya sing disaranake dening Fleischner Society 29.Nanging, nodul sing luwih gedhe tinimbang 6 mm lan tanpa fitur jinak sing jelas, sing diarani nodul paru indeterminate (IPN), tetep dadi tantangan utama ing evaluasi lan manajemen ing praktik klinis30,31.Sabanjure, kita nliti manawa ukuran nodul mengaruhi tandha metabolomik nggunakake conto sing dikumpulake saka panemuan lan kohort validasi internal.Fokus ing 27 biomarker sing wis divalidasi, kita mbandhingake profil PCA saka HC lan BN sub-6 mm metabolom.Kita nemokake manawa umume titik data kanggo HC lan BN tumpang tindih, nuduhake yen tingkat metabolit serum padha ing loro klompok kasebut (Gambar 3a).Peta fitur ing kisaran ukuran sing beda-beda tetep disimpen ing BN lan LA (Gambar 3b, c), dene pamisahan diamati antarane nodul ganas lan jinak ing kisaran 6-20 mm (Gambar 3d).Kohort iki nduweni AUC 0,927, spesifisitas 0,868, lan sensitivitas 0,820 kanggo prédhiksi keganasan nodul ukuran 6 nganti 20 mm (Gambar 3e, f).Asil kita nuduhake yen classifier bisa njupuk owah-owahan metabolisme sing disebabake dening transformasi ganas awal, preduli saka ukuran nodule.
Perbandingan profil PCA antarane klompok tartamtu adhedhasar klasifikasi metabolit 27 metabolit.CC lan BN <6 mm.b BN <6 mm vs BN 6–20 mm.ing LA 6–20 mm lawan LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm lan LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e kurva karakteristik operasi panrima (ROC) nuduhake kinerja model diskriminan kanggo nodul 6-20 mm.f Nilai probabilitas diitung adhedhasar model regresi logistik kanggo nodul sing ukurane 6-20 mm.Garis burik abu-abu nggambarake nilai cutoff optimal (0,455).Nomer ing ndhuwur nuduhake persentase kasus sing diramalake kanggo Los Angeles.Gunakake tes t Student loro-buntut.PCA, analisis komponen utama.Area AUC ing sangisore kurva.Data sumber diwenehake kanthi wujud file data sumber.
Papat sampel (umur 44-61 taun) kanthi ukuran nodul paru-paru sing padha (7-9 mm) luwih dipilih kanggo nggambarake kinerja model prediksi keganasan sing diusulake (Gambar 4a, b).Ing screening awal, Kasus 1 ditampilake minangka nodul padhet kanthi kalsifikasi, fitur sing ana hubungane karo jinak, dene Kasus 2 ditampilake minangka nodul padhet sing ora ditemtokake kanthi ora ana fitur entheng sing jelas.Telung babak saka tindak lanjut CT scan nuduhake yen kasus-kasus kasebut tetep stabil sajrone periode 4 taun lan mulane dianggep nodul entheng (Gambar 4a).Dibandhingake karo evaluasi klinis saka scan CT serial, analisis metabolit serum siji-shot karo model klasifikasi saiki kanthi cepet lan kanthi bener ngenali nodul sing entheng iki adhedhasar kendala probabilistik (Tabel 1).Gambar 4b ing kasus 3 nuduhake nodul kanthi tandha retraksi pleura, sing paling kerep digandhengake karo malignancy32.Kasus 4 dituduhake minangka nodul parsial sing ora ditemtokake kanthi ora ana bukti sabab sing entheng.Kabeh kasus kasebut diprediksi minangka ganas miturut model klasifikasi (Tabel 1).Evaluasi adenokarsinoma paru-paru dituduhake kanthi pemeriksaan histopatologis sawise operasi reseksi paru-paru (Gambar 4b).Kanggo set validasi eksternal, klasifikasi metabolik kanthi akurat prédhiksi rong kasus nodul paru-paru sing ora ditemtokake sing luwih gedhe tinimbang 6 mm (Tambahan Gambar 10).
Gambar CT saka jendhela aksial paru-paru saka rong kasus nodul jinak.Ing kasus 1, CT scan sawise 4 taun nuduhake nodul padhet stabil ukuran 7 mm karo kalsifikasi ing lobus tengen ngisor.Ing kasus 2, CT scan sawise 5 taun nuduhake nodul sing stabil, sebagian padhet kanthi diameter 7 mm ing lobus ndhuwur sisih tengen.b Gambar CT jendhela aksial paru-paru lan studi patologis sing cocog karo rong kasus adenokarsinoma tahap I sadurunge reseksi paru-paru.Kasus 3 nuduhake nodul kanthi diameter 8 mm ing lobus ndhuwur sisih tengen kanthi retraksi pleura.Kasus 4 nuduhake nodul kaca lemah sing padhet ukuran 9 mm ing lobus ndhuwur kiwa.Pewarnaan hematoxylin lan eosin (H&E) saka jaringan paru-paru sing direseksi (bar skala = 50 μm) nuduhake pola pertumbuhan acinar adenokarsinoma paru-paru.Panah nuduhake nodul sing dideteksi ing gambar CT.Gambar H&E minangka gambar perwakilan saka pirang-pirang (>3) lapangan mikroskopik sing diteliti dening ahli patologi.
Digabungake, asil kita nuduhake nilai potensial biomarker metabolit serum ing diagnosis diferensial nodul paru, sing bisa nyebabake tantangan nalika ngevaluasi skrining CT.
Adhedhasar panel metabolit diferensial sing wis divalidasi, kita ngupaya ngenali korélasi biologis saka owah-owahan metabolisme utama.Analisis pengayaan jalur KEGG dening MetaboAnalyst ngenali 6 jalur umum sing diowahi sacara signifikan ing antarane rong kelompok kasebut (LA vs. HC lan LA vs BN, diatur p ≤ 0.001, efek> 0.01).Owah-owahan kasebut ditondoi kanthi gangguan metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin lan nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, lan metabolisme purin (Gambar 5a).Kita banjur nindakake metabolomik sing ditargetake kanggo verifikasi owah-owahan utama nggunakake kuantifikasi absolut.Penentuan metabolit umum ing jalur sing umum diowahi kanthi spektrometri massa quadrupole triple (QQQ) nggunakake standar metabolit asli.Karakteristik demografi saka sampel target sinau metabolomik kalebu ing Tabel Tambahan 4. Konsisten karo asil metabolomik global kita, analisis kuantitatif dikonfirmasi yen hypoxanthine lan xanthine, piruvate, lan laktat tambah ing LA dibandhingake karo BN lan HC (Gambar 5b, c, p <0,05).Nanging, ora ana bedane sing signifikan ing metabolit kasebut ing antarane BN lan HC.
Analisis pengayaan jalur KEGG saka metabolit sing beda banget ing klompok LA dibandhingake karo klompok BN lan HC.Globaltest loro-buntut digunakake, lan nilai p disetel nggunakake metode Holm-Bonferroni (diatur p ≤ 0,001 lan ukuran efek> 0,01).b-d Plot biola nuduhake tingkat hypoxanthine, xanthine, laktat, piruvat, lan triptofan ing serum HC, BN, lan LA sing ditemtokake dening LC-MS / MS (n = 70 saben klompok).Garis burik putih lan ireng nuduhake median lan kuartil.e Plot biola sing nuduhake ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip saben yuta) sing dinormalisasi saka SLC7A5 lan QPRT ing adenokarsinoma paru-paru (n = 513) dibandhingake karo jaringan paru-paru normal (n = 59) ing dataset LUAD-TCGA.Kothak putih makili sawetara interquartile, garis ireng horisontal ing tengah nggantosi median, lan garis ireng vertikal ndawakake saka kothak nggantosi 95% interval kapercayan (CI).f Plot korelasi Pearson saka ekspresi SLC7A5 lan GAPDH ing adenokarsinoma paru-paru (n = 513) lan jaringan paru-paru normal (n = 59) ing dataset TCGA.Wilayah abu-abu nggambarake 95% CI.r, Koefisien korélasi Pearson.g Normalisasi tingkat tryptophan seluler ing sel A549 sing ditransfeksi kanthi kontrol shRNA nonspesifik (NC) lan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sing ditemtokake dening LC-MS / MS.Analisis statistik saka limang sampel bebas biologis ing saben klompok ditampilake.h Tingkat seluler NADt (total NAD, kalebu NAD + lan NADH) ing sel A549 (NC) lan sel A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).Analisis statistik saka telung sampel bebas biologis ing saben klompok ditampilake.Aktivitas glikolitik sel A549 sadurunge lan sawise knockdown SLC7A5 diukur kanthi tingkat acidifikasi ekstraselular (ECAR) (n = 4 sampel bebas biologis saben klompok).2-DG, 2-deoksi-D-glukosa.Uji t Siswa rong buntut digunakake ing (b–h).Ing (g-i), bar kesalahan nuduhake rata-rata ± SD, saben eksperimen ditindakake kaping telu kanthi mandiri lan asile padha.Data sumber diwenehake kanthi wujud file data sumber.
Ngelingi dampak signifikan saka metabolisme tryptophan sing diowahi ing klompok LA, kita uga ngevaluasi tingkat tryptophan serum ing klompok HC, BN, lan LA nggunakake QQQ.Kita nemokake yen tryptophan serum dikurangi ing LA dibandhingake karo HC utawa BN (p <0.001, Gambar 5d), sing konsisten karo temuan sadurunge yen tingkat tryptophan sing sirkulasi luwih murah ing pasien kanker paru-paru tinimbang ing kontrol sehat saka grup kontrol33,34 ,35.Panaliten liyane nggunakake PET / CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan nemokake manawa wektu retensi sinyal triptofan ing jaringan kanker paru-paru saya tambah akeh dibandhingake karo lesi jinak utawa jaringan normal36.Kita hipotesis manawa penurunan tryptophan ing serum LA bisa nggambarake penyerapan triptofan aktif dening sel kanker paru-paru.
Uga dikenal manawa produk pungkasan saka jalur kynurenine saka katabolisme triptofan yaiku NAD + 37,38, sing minangka substrat penting kanggo reaksi gliseraldehida-3-fosfat kanthi 1,3-bisphosphoglycerate ing glikolisis39.Nalika panaliten sadurunge wis fokus ing peran katabolisme tryptophan ing regulasi kekebalan, kita ngupaya njlentrehake interaksi antarane dysregulation tryptophan lan jalur glikolitik sing diamati ing panliten saiki.Solute transporter kulawarga 7 anggota 5 (SLC7A5) dikenal minangka transporter triptofan43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) minangka enzim sing dumunung ing hilir saka jalur kynurenine sing ngowahi asam quinolinic dadi NAMN46.Inspeksi dataset LUAD TCGA ngandhakake yen loro SLC7A5 lan QPRT sacara signifikan ditingkatake ing jaringan tumor dibandhingake karo jaringan normal (Gambar 5e).Tambah iki diamati ing tahap I lan II uga tahap III lan IV saka adenokarsinoma paru-paru (Tambahan Gambar 11), nuduhake gangguan awal ing metabolisme tryptophan sing ana gandhengane karo tumorigenesis.
Kajaba iku, dataset LUAD-TCGA nuduhake korélasi positif antarane ekspresi mRNA SLC7A5 lan GAPDH ing sampel pasien kanker (r = 0.45, p = 1.55E-26, Gambar 5f).Ing kontras, ora ana korélasi sing signifikan ing antarane tandha gen kasebut ing jaringan paru-paru normal (r = 0.25, p = 0.06, Gambar 5f).Knockdown SLC7A5 (Tambahan Gambar 12) ing sel A549 nyuda tingkat tryptophan seluler lan NAD (H) kanthi signifikan (Gambar 5g, h), nyebabake aktivitas glikolitik sing dikurangi sing diukur kanthi tingkat pengasaman ekstraselular (ECAR) (Gambar 1).5i).Mangkono, adhedhasar owah-owahan metabolisme ing serum lan deteksi in vitro, kita hipotesis yen metabolisme tryptophan bisa ngasilake NAD + liwat jalur kynurenine lan duwe peran penting kanggo ningkatake glikolisis ing kanker paru-paru.
Pasinaon wis nuduhake yen akeh nodul paru sing ora ditemtokake sing dideteksi dening LDCT bisa nyebabake perlu kanggo tes tambahan kayata PET-CT, biopsi paru-paru, lan overtreatment amarga diagnosis malignancy sing positif palsu.31 Kaya sing dituduhake ing Gambar 6, panaliten kita nemtokake panel metabolit serum kanthi nilai diagnostik potensial sing bisa ningkatake stratifikasi risiko lan manajemen nodul paru-paru sing dideteksi dening CT.
Nodul paru dievaluasi nggunakake low-dosis computed tomography (LDCT) kanthi fitur pencitraan sing nuduhake panyebab jinak utawa ganas.Asil nodul sing ora mesthi bisa nyebabake kunjungan tindak lanjut sing kerep, intervensi sing ora perlu, lan overtreatment.Inklusi klasifikasi metabolik serum kanthi nilai diagnostik bisa nambah penilaian risiko lan manajemen nodul paru-paru.PET positron emission tomography.
Data saka studi NLST AS lan studi NELSON Eropa nuduhake yen skrining kelompok berisiko tinggi kanthi tomografi komputasi dosis rendah (LDCT) bisa nyuda mortalitas kanker paru-paru1,3.Nanging, penilaian risiko lan manajemen klinis sakteruse saka akeh nodul paru-paru insidental sing dideteksi dening LDCT tetep paling tantangan.Tujuan utama yaiku ngoptimalake klasifikasi sing bener saka protokol basis LDCT sing ana kanthi nggabungake biomarker sing bisa dipercaya.
Biomarker molekuler tartamtu, kayata metabolit getih, wis diidentifikasi kanthi mbandhingake kanker paru-paru kanthi kontrol sehat15,17.Ing panaliten saiki, kita fokus ing aplikasi analisis metabolomik serum kanggo mbedakake antara nodul paru-paru jinak lan ganas sing ora sengaja dideteksi dening LDCT.Kita mbandhingake metabolom serum global saka kontrol sehat (HC), nodul paru-paru jinak (BN), lan sampel adenokarsinoma paru-paru tahap I (LA) nggunakake analisis UPLC-HRMS.Kita nemokake yen HC lan BN duwe profil metabolik sing padha, dene LA nuduhake owah-owahan sing signifikan dibandhingake karo HC lan BN.Kita nemtokake rong set metabolit serum sing mbedakake LA saka HC lan BN.
Skema identifikasi berbasis LDCT saiki kanggo nodul jinak lan ganas utamane adhedhasar ukuran, kapadhetan, morfologi lan tingkat pertumbuhan nodul sajrone wektu30.Panaliten sadurunge nuduhake yen ukuran nodul raket banget karo kemungkinan kanker paru-paru.Malah ing pasien kanthi risiko dhuwur, risiko ganas ing kelenjar <6 mm <1%.Resiko ganas kanggo nodul sing ukurane 6 nganti 20 mm antara 8% nganti 64%30.Mulane, Fleischner Society nyaranake diameter cutoff 6 mm kanggo rutin CT tindakake-munggah.29 Nanging, penilaian risiko lan manajemen nodul pulmonary indeterminate (IPN) sing luwih gedhe tinimbang 6 mm durung ditindakake kanthi cukup 31.Manajemen penyakit jantung kongenital saiki biasane adhedhasar nunggu sing waspada kanthi pemantauan CT sing kerep.
Adhedhasar metabolom sing wis divalidasi, kita nuduhake pisanan tumpang tindih tandha metabolomik antarane wong sing sehat lan nodul jinak <6 mm.Persamaan biologis konsisten karo temuan CT sadurunge yen risiko ganas kanggo nodul <6 mm kurang saka subyek tanpa node.30 Perlu dicathet yen asil kita uga nduduhake yen nodul jinak <6 mm lan ≥6 mm nduweni dhuwur. mirip ing profil metabolomik, nuduhake yen definisi fungsional saka etiologi jinak konsisten preduli saka ukuran nodule.Mangkono, panel metabolit serum diagnostik modern bisa nyedhiyakake tes siji minangka tes aturan nalika nodul pisanan dideteksi ing CT lan bisa nyuda pemantauan serial.Ing wektu sing padha, panel biomarker metabolik sing padha mbedakake nodul ganas ukuran ≥6 mm saka nodul jinak lan nyedhiyakake prediksi akurat kanggo IPN sing ukurane padha lan fitur morfologis sing ambigu ing gambar CT.Klasifikasi metabolisme serum iki nindakake kanthi apik kanggo prédhiksi keganasan nodul ≥6 mm kanthi AUC 0,927.Digabungake, asil kita nuduhake yen tandha metabolomik serum sing unik bisa uga nggambarake owah-owahan metabolisme sing disebabake dening tumor awal lan duweni nilai potensial minangka prediktor risiko, ora gumantung saka ukuran nodul.
Utamane, adenokarsinoma paru-paru (LUAD) lan karsinoma sel skuamosa (LUSC) minangka jinis utama kanker paru-paru non-sel cilik (NSCLC).Amarga LUSC digandhengake banget karo panggunaan tembakau47 lan LUAD minangka histologi paling umum saka nodul paru-paru insidental sing dideteksi ing skrining CT48, model klasifikasi kita digawe khusus kanggo sampel adenokarsinoma tahap I.Wang lan kanca-kanca uga fokus ing LUAD lan ngenali sangang tandha lipid nggunakake lipidomics kanggo mbedakake kanker paru-paru tahap awal saka individu sehat17.Kita nguji model klasifikasi saiki ing 16 kasus tahap I LUSC lan 74 nodul jinak lan mirsani akurasi prediksi LUSC sing kurang (AUC 0.776), nuduhake yen LUAD lan LUSC bisa uga duwe tandha metabolomik dhewe.Pancen, LUAD lan LUSC wis ditampilake beda ing etiologi, asal biologi lan aberasi genetik49.Mulane, jinis histologi liyane kudu dilebokake ing model latihan kanggo deteksi kanker paru-paru adhedhasar populasi ing program skrining.
Ing kene, kita nemtokake enem jalur sing paling kerep diowahi ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol sehat lan nodul entheng.Xanthine lan hypoxanthine minangka metabolit umum saka jalur metabolisme purin.Selaras karo asil kita, intermediet sing ana gandhengane karo metabolisme purin tambah akeh ing serum utawa jaringan pasien karo adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol sehat utawa pasien ing tahap preinvasive15,50.Tingkat xanthine lan hypoxanthine serum sing munggah pangkat bisa nggambarake anabolisme sing dibutuhake dening sel kanker sing berkembang kanthi cepet.Disregulasi metabolisme glukosa minangka ciri khas metabolisme kanker51.Ing kene, kita ndeleng kenaikan piruvat lan laktat sing signifikan ing klompok LA dibandhingake karo klompok HC lan BN, sing konsisten karo laporan sadurunge kelainan jalur glikolitik ing profil metabolom serum pasien kanker paru-paru sel non-cilik (NSCLC) lan kontrol sehat.asile konsisten52,53.
Sing penting, kita mirsani korélasi kuwalik antara metabolisme piruvat lan triptofan ing serum adenokarsinoma paru-paru.Tingkat tryptophan serum dikurangi ing klompok LA dibandhingake karo klompok HC utawa BN.Sing nggumunake, panaliten skala gedhe sadurunge nggunakake kohort prospektif nemokake yen tingkat tryptophan sing kurang sirkulasi digandhengake karo risiko kanker paru-paru 54.Tryptophan minangka asam amino penting sing kita entuk kabeh saka panganan.Kita nyimpulake yen deplesi tryptophan serum ing adenokarsinoma paru-paru bisa nggambarake penipisan metabolit iki kanthi cepet.Dikenal manawa produk akhir katabolisme triptofan liwat jalur kynurenine minangka sumber sintesis de novo NAD +.Amarga NAD + diprodhuksi utamane liwat jalur penyelamatan, pentinge NAD + ing metabolisme tryptophan ing kesehatan lan penyakit tetep kudu ditemtokake46.Analisis basis data TCGA nuduhake yen ekspresi transporter solute transporter triptofan 7A5 (SLC7A5) tambah akeh ing adenokarsinoma paru-paru dibandhingake karo kontrol normal lan ana hubungane positif karo ekspresi enzim glikolitik GAPDH.Panaliten sadurunge utamane fokus ing peran katabolisme tryptophan kanggo nyuda respon imun antitumor40,41,42.Ing kene kita nduduhake yen inhibisi penyerapan tryptophan kanthi ngrusak SLC7A5 ing sel kanker paru-paru nyebabake nyuda tingkat NAD seluler lan nyuda aktivitas glikolitik.Ing ringkesan, panaliten kita nyedhiyakake basis biologis kanggo owah-owahan metabolisme serum sing ana gandhengane karo transformasi ganas adenokarsinoma paru-paru.
Mutasi EGFR minangka mutasi driver sing paling umum ing pasien karo NSCLC.Ing panliten kita, kita nemokake yen pasien karo mutasi EGFR (n = 41) duwe profil metabolomik sakabèhé padha karo pasien karo EGFR tipe liar (n = 31), sanajan kita nemokake penurunan tingkat serum saka sawetara pasien mutan EGFR ing pasien acylcarnitine.Fungsi acylcarnitines sing wis ditemtokake yaiku kanggo ngeterake gugus asil saka sitoplasma menyang matriks mitokondria, sing nyebabake oksidasi asam lemak kanggo ngasilake energi 55.Konsisten karo temuan kita, panaliten anyar uga ngenali profil metabolom sing padha ing antarane mutan EGFR lan tumor tipe liar EGFR kanthi nganalisa metabolom global 102 sampel jaringan adenokarsinoma paru-paru50.Apike, isi acylcarnitine uga ditemokake ing grup mutan EGFR.Mulane, manawa owah-owahan ing tingkat acylcarnitine nggambarake owah-owahan metabolisme sing diakibatake EGFR lan jalur molekul sing ndasari bisa uga kudu sinau luwih lanjut.
Kesimpulane, panliten kita netepake klasifikasi metabolik serum kanggo diagnosis diferensial nodul paru-paru lan ngusulake alur kerja sing bisa ngoptimalake penilaian risiko lan nggampangake manajemen klinis adhedhasar screening CT scan.
Panliten iki disetujoni dening Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, lan Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou.Ing panemuan lan grup validasi internal, 174 sera saka individu sing sehat lan 244 sera saka nodul jinak diklumpukake saka individu sing ngalami pemeriksaan medis taunan ing Departemen Kontrol lan Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, lan 166 nodul jinak.serum.Adenokarsinoma paru-paru tahap I diklumpukake saka Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen.Ing kohort validasi eksternal, ana 48 kasus nodul jinak, 39 kasus adenokarsinoma paru-paru tahap I saka Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, lan 24 kasus adenokarsinoma paru-paru tahap I saka Rumah Sakit Kanker Zhengzhou.Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen uga nglumpukake 16 kasus kanker paru-paru sel skuamosa tahap I kanggo nguji kemampuan diagnostik saka klasifikasi metabolik sing diadegake (karakteristik pasien ditampilake ing Tabel Tambahan 5).Sampel saka kohort panemuan lan kohort validasi internal diklumpukake antarane Januari 2018 lan Mei 2020. Sampel kanggo kohort validasi eksternal diklumpukake antarane Agustus 2021 lan Oktober 2022. Kanggo nyilikake bias jender, kira-kira jumlah kasus lanang lan wadon sing padha ditugasake kanggo saben. kohort.Tim Penemuan lan Tim Review Internal.Jenis kelamin peserta ditemtokake adhedhasar laporan dhewe.Informed consent ditampa saka kabeh peserta lan ora ana kompensasi.Subjek kanthi nodul jinak yaiku skor scan CT sing stabil ing 2 nganti 5 taun nalika analisis, kajaba 1 kasus saka sampel validasi eksternal, sing dikumpulake sadurunge operasi lan didiagnosis kanthi histopatologi.Kajaba bronkitis kronis.Kasus adenokarsinoma paru-paru diklumpukake sadurunge reseksi paru-paru lan dikonfirmasi kanthi diagnosis patologis.Sampel getih pasa diklumpukake ing tabung pamisahan serum tanpa antikoagulan.Sampel getih diklumpukake sajrone 1 jam ing suhu kamar lan banjur disentrifugasi ing 2851 × g suwene 10 menit ing suhu 4 ° C kanggo ngumpulake supernatan serum.Aliquot serum beku ing -80 ° C nganti ekstraksi metabolit.Departemen Pencegahan Kanker lan Pemeriksaan Kedokteran Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen nglumpukake serum saka 100 donor sehat, kalebu jumlah lanang lan wadon umur 40 nganti 55 taun sing padha.Volume sing padha saka saben sampel donor dicampur, blumbang sing diasilake diasingake lan disimpen ing -80 ° C.Campuran serum digunakake minangka bahan referensi kanggo kontrol kualitas lan standarisasi data.
Serum referensi lan sampel tes dilebur lan metabolit diekstraksi nggunakake metode ekstraksi gabungan (MTBE/metanol/banyu) 56 .Sedhela, 50 μl serum dicampur karo 225 μl metanol kadhemen es lan 750 μl es metil tert-butil eter (MTBE).Campuran dicampur lan inkubasi ing es nganti 1 jam.Sampel kasebut banjur dicampur lan vorteks dicampur karo 188 μl banyu kelas MS sing ngemot standar internal (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, lan 13C6-isoleucine, sing dituku saka Cambridge Isotope Laboratories).Campuran kasebut banjur disentrifugasi ing 15.000 × g kanggo 10 menit ing 4 ° C, lan fase ngisor ditransfer menyang rong tabung (125 μL saben) kanggo analisis LC-MS ing mode positif lan negatif.Pungkasan, sampel diuap nganti garing ing konsentrator vakum kanthi kacepetan dhuwur.
Metabolit sing garing dikonstitusi maneh ing 120 μl asetonitril 80%, vortexed kanggo 5 menit, lan sentrifugasi ing 15.000 × g kanggo 10 menit ing 4 ° C.Supernatan ditransfer menyang vial kaca amber kanthi microinserts kanggo studi metabolomik.Analisis metabolomik sing ora ditargetake ing platform spektrometri massa spektrometri massa ultra-kinerja ultra-kinerja (UPLC-HRMS).Metabolit dipisahake nggunakake sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC lan kolom ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Ing mode ion positif, fase seluler yaiku 95% (A) lan 50% asetonitril (B), saben ngemot 10 mmol/L amonium asetat lan 0,1% asam format.Ing mode negatif, fase seluler A lan B ngemot asetonitril 95% lan 50%, loro fase kasebut ngemot 10 mmol / L amonium asetat, pH = 9. Program gradien kaya ing ngisor iki: 0-0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 menit, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 min, 2% B. Kolom dijaga ing 40 ° C lan sampel ing 10 ° C ing autosampler.Laju aliran yaiku 0,3 ml / menit, volume injeksi yaiku 3 μl.Spektrometer massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) kanthi sumber ionisasi electrospray (ESI) dilakokno ing mode scan lengkap lan ditambah karo mode ngawasi ddMS2 kanggo ngumpulake volume data sing akeh.Parameter MS disetel kaya ing ngisor iki: voltase semprotan +3.8 kV/- 3.2 kV, suhu kapiler 320°C, gas pelindung 40 arb, gas tambahan 10 arb, suhu pemanas probe 350°C, jarak pemindaian 70–1050 m/jam, resolusi.70 000. Data dipikolehi nggunakake Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Kanggo netepake kualitas data, sampel kontrol kualitas (QC) sing dikumpulake digawe kanthi ngilangi 10 μL aliquot supernatant saka saben sampel.Enem injeksi sampel kontrol kualitas dianalisis ing wiwitan urutan analitis kanggo netepake stabilitas sistem UPLC-MS.Sampel kontrol kualitas banjur dilebokake sacara periodik menyang batch.Kabeh 11 batch sampel serum ing panliten iki dianalisis dening LC-MS.Aliquot saka campuran blumbang serum saka 100 donor sehat digunakake minangka bahan referensi ing kelompok masing-masing kanggo ngawasi proses ekstraksi lan nyetel efek batch-to-batch.Analisis metabolomik sing ora ditargetake saka kohort panemuan, kohort validasi internal, lan kohort validasi eksternal ditindakake ing Pusat Metabolomik Universitas Sun Yat-sen.Laboratorium eksternal Universitas Guangdong Analisis Teknologi lan Pusat Pengujian uga nganalisa 40 conto saka kohort eksternal kanggo nguji kinerja model klasifikasi.
Sawise ekstraksi lan rekonstitusi, kuantitas absolut metabolit serum diukur nggunakake spektrometri massa kromatografi-tandem cair kinerja ultra-tinggi (Agilent 6495 triple quadrupole) kanthi sumber ionisasi electrospray (ESI) ing mode pemantauan reaksi (MRM).Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) digunakake kanggo misahake metabolit.Fase gerak dumadi saka 90% (A) lan 5% asetonitril (B) kanthi 10 mmol/L amonium asetat lan larutan amonia 0,1%.Program gradien kaya ing ngisor iki: 0-1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8.5–11.5 mnt, 0%B.Kolom kasebut dijaga ing 40 ° C lan sampel ing 10 ° C ing autosampler.Laju aliran yaiku 0,3 mL / menit lan volume injeksi yaiku 1 μL.Paramèter MS disetel kaya ing ngisor iki: tegangan kapiler ± 3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas sheath 12 L/menit, suhu gas sheath 350°C, suhu gas pengeringan 250°C, lan aliran gas pangatusan 14 l/menit.Konversi MRM triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin lan xanthine yaiku 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 lan 151.0–107.9 mungguh.Data diklumpukake nggunakake Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Kanggo conto serum, triptofan, piruvat, laktat, hypoxanthine, lan xanthine diukur nggunakake kurva kalibrasi larutan campuran standar.Kanggo conto sel, isi triptofan dinormalisasi menyang standar internal lan massa protein sel.
Ekstraksi puncak (m / z lan wektu retensi (RT)) ditindakake nggunakake Compound Discovery 3.1 lan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Kanggo ngilangi beda potensial antarane kumpulan, saben puncak karakteristik saka sampel test dipérang dening puncak karakteristik saka materi referensi saka kumpulan padha kanggo njupuk turah mbrawah relatif.Panyimpangan standar relatif saka standar internal sadurunge lan sawise standarisasi ditampilake ing Tabel Tambahan 6. Bedane antarane rong klompok kasebut ditondoi kanthi tingkat panemuan palsu (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) lan owah-owahan lipatan (> 1.2 utawa <0.83).Data MS mentah saka fitur sing diekstrak lan referensi data MS sing dikoreksi serum ditampilake ing Data Tambahan 1 lan Data Tambahan 2, masing-masing.Anotasi puncak dileksanakake adhedhasar papat tingkat identifikasi sing ditemtokake, kalebu metabolit sing diidentifikasi, senyawa anotasi sing diduga, kelas senyawa sing dicirikan, lan senyawa sing ora dingerteni 22.Adhedhasar telusuran basis data ing Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), senyawa biologis kanthi standar sing divalidasi sing cocog karo MS / MS utawa anotasi sing cocog ing mzCloud (skor> 85) utawa Chemspider pungkasane dipilih minangka perantara antarane metabolom diferensial.Anotasi puncak kanggo saben fitur kalebu ing Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 digunakake kanggo analisis univariat saka jumlah metabolit sing dinormalisasi.MetaboAnalyst 5.0 uga ngevaluasi analisis pengayaan jalur KEGG adhedhasar metabolit sing beda banget.analisis komponen Principal (PCA) lan analisis diskriminan parsial paling kothak (PLS-DA) dianalisis nggunakake paket software ropls (v.1.26.4) karo normalisasi tumpukan lan autoscaling.Model biomarker metabolit optimal kanggo prédhiksi keganasan nodul digawe nggunakake regresi logistik binar kanthi operator shrinkage lan pilihan sing paling ora mutlak (LASSO, paket R v.4.1-3).Kinerja model diskriminan ing set deteksi lan validasi ditondoi kanthi ngira AUC adhedhasar analisis ROC miturut paket pROC (v.1.18.0.).Cutoff kemungkinan optimal dipikolehi adhedhasar indeks Youden maksimum model (sensitivitas + spesifik - 1).Sampel kanthi nilai kurang utawa luwih saka ambang bakal diprediksi minangka nodul jinak lan adenokarsinoma paru-paru.
Sel A549 (#CCL-185, Koleksi Budaya Tipe Amerika) ditanam ing medium F-12K sing ngemot 10% FBS.Urutan RNA jepit rambut cendhak (shRNA) sing ngarahake SLC7A5 lan kontrol nontargeting (NC) dilebokake ing vektor lentiviral pLKO.1-puro.Urutan antisense shSLC7A5 kaya ing ngisor iki: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 ′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3 ′).Antibodi kanggo SLC7A5 (# 5347) lan tubulin (# 2148) dituku saka Cell Signaling Technology.Antibodi kanggo SLC7A5 lan tubulin digunakake ing pengenceran 1:1000 kanggo analisis Western blot.
Tes Stres Glikolitik Seahorse XF ngukur tingkat pengasaman ekstraselular (ECAR).Ing tes kasebut, glukosa, oligomisin A, lan 2-DG diwenehake kanthi urutan kanggo nguji kapasitas glikolitik seluler sing diukur dening ECAR.
Sel A549 sing ditransfeksi kanthi kontrol non-target (NC) lan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) dilapisi sewengi ing piring diameter 10 cm.Metabolit sel diekstrak nganggo 1 ml metanol banyu 80% kadhemen es.Sèl-sèl ing larutan metanol dikerok, diklumpukake ing tabung anyar, lan disentrifugasi ing 15.000 × g suwene 15 menit ing suhu 4°C.Ngumpulake 800 µl supernatant lan garing nggunakake konsentrator vakum kacepetan dhuwur.Pelet metabolit garing banjur dianalisis kanggo tingkat triptofan nggunakake LC-MS / MS kaya sing kasebut ing ndhuwur.Tingkat NAD (H) seluler ing sel A549 (NC lan shSLC7A5) diukur nggunakake kit colorimetric NAD + / NADH kuantitatif (#K337, BioVision) miturut pandhuan pabrikan.Tingkat protein diukur kanggo saben sampel kanggo normalake jumlah metabolit.
Ora ana cara statistik digunakake kanggo preliminarily nemtokake ukuran sampel.Pasinaon metabolomik sadurunge sing dituju kanggo nemokake biomarker15,18 wis dianggep minangka tolok ukur kanggo nemtokake ukuran, lan dibandhingake karo laporan kasebut, sampel kita cukup.Ora ana conto sing ora kalebu saka kohort sinau.Sampel serum ditugasake kanthi acak menyang klompok panemuan (306 kasus, 74.6%) lan klompok validasi internal (104 kasus, 25.4%) kanggo studi metabolomik sing ora ditargetake.Kita uga milih kasus 70 kanthi acak saka saben klompok saka set panemuan kanggo studi metabolomik sing ditargetake.Penyidik dibutakan kanggo tugas kelompok sajrone nglumpukake lan analisis data LC-MS.Analisis statistik data metabolomik lan eksperimen sel diterangake ing bagean Asil, Legenda Gambar, lan Metode.Kuantifikasi aktivitas triptofan seluler, NADT, lan glikolitik ditindakake kaping telu kanthi mandiri kanthi asil sing padha.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain sinau, waca Abstrak Laporan Portofolio Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.
Data MS mentah saka fitur sing diekstrak lan data MS sing dinormalisasi saka serum referensi ditampilake ing Data Tambahan 1 lan Data Tambahan 2, masing-masing.Anotasi puncak kanggo fitur diferensial ditampilake ing Data Tambahan 3. Dataset LUAD TCGA bisa didownload saka https://portal.gdc.cancer.gov/.Data input kanggo ngrancang grafik diwenehake ing data sumber.Data sumber kasedhiya kanggo artikel iki.
National Lung Screening Study Group, etc. Ngurangi kematian kanker paru-paru kanthi tomografi komputasi dosis rendah.Inggris Lor.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR lan Nabi, screening kanker paru-paru PC nggunakake helical CT dosis rendah: asil saka National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Layar 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Ngurangi kematian kanker paru-paru kanthi screening CT volumetrik ing uji coba acak.Inggris Lor.J. Med.382, 503–513 (2020).
Wektu kirim: Sep-18-2023